авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

На правах рукописи

Тищенко Светлана Викторовна

ИССЛЕДОВАНИЕ РНК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В

КОМПЛЕКСАХ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ С РИБОСОМНЫМИ

И МАТРИЧНЫМИ РНК

молекулярная биология 03.01.03

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Пущино-2015

Гарбер Мария Борисовна

Никонов Станислав Владимирович

Официальные оппоненты:

Сергиев Пётр Владимирович

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

доктор химических наук, профессор

кафедры химии природных соединений

химического факультета Московского

государственного университета им. М.В.

Ломоносова

Кулаковская Татьяна Валентиновна доктор биологических наук, заведующая

лабораторией регуляции биохимических

процессов Федерального

государственного бюджетного

учреждения науки Института биохимии и

физиологии микроорганизмов им. Г. К.

Скрябина РАН

Полозов Роберт Валентинович

доктор физико-математических наук,

ведущий научный сотрудник

лаборатории физической биохимии

Федерального государственного

бюджетного учреждения науки

Института теоретической и

экспериментальной биофизики РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится « 3 » марта 2016 года в 14 ч. 00 мин.

на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 Федерального государственного

бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки Российской академии

наук по адресу: 142290, г. Пущино Московская область, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского

научного центра РАН.

Автореферат разослан «

»

2015 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

Смолихина

кандидат биологических наук

Татьяна Ивановна

2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки

Институте белка Российской академии наук

Научные консультанты:

Актуальность проблемы. Биосинтез белка, проходящий на рибосомах,

является основным процессом жизнедеятельности живой клетки. Определение

принципов структурной организации рибосомы и молекулярных механизмов

трансляции является одной из актуальных проблем молекулярной биологии.

Для детального понимания механизма биосинтеза белка необходимо детальное

знание структуры компонентов рибосомы и взаимодействий между ними.

Структурные исследования рибосомы и её комплексов с лигандами являются

необходимым

этапом

в

исследовании

функционирования

рибосомы.

Определение в начале текущего тысячелетия кристаллических структур

бактериальной и архейной рибосом и их субчастиц стало важной вехой в

исследовании механизма биосинтеза белка. При определении структуры

рибосомы были использованы полученные ранее данные по специфическому

взаимодействию рибосомных белков с фрагментами рибосомных РНК и

структуры

изолированных

рибосомных

белков

и

их

комплексов

со

специфическими фрагментами рРНК. Большой вклад в определение структур

рибосомных белков и их комплексов с РНК был внесён работами,

проводившимися в Институте белка РАН. Вписывание известных структур

рибосомных белков и их комплексов с РНК в модель рибосомы позволило

получить достоверную картину расположения рибосомных белков (р-белков)

на субчастицах, а также детально описать их взаимодействие с рРНК.

Известно, что некоторые рибосомные белки являются регуляторами

своего синтеза и синтеза белков, находящихся с генами этих белков в одном

опероне. К таким белкам относятся и белки S8 и L1, исследования которых

описаны в представляемой диссертации. В данной работе впервые был

проведён детальный анализ РНК-белковых взаимодействий в рибосомном и

регуляторном комплексах р-белка L1 и определены структурные элементы,

ответственные за регуляторные свойства белка и РНК.

Определённые нами структуры комплексов белков S8 и L1 с рРНК

использовались

для

интерпретации

электронных

карт

рибосомы,

а

сравнительный структурный анализ регуляторных и рибосомных комплексов

белка L1 позволил определить структурные основы регуляции экспрессии гена

белка L1 в бактериях и археях. В данной диссертационной работе разработан

новый подход к исследованию РНК-белковых взаимодействий рибосомных

белков, заключающийся в совмещении анализа структур с кинетическим

анализом взаимодействий методом поверхностного резонанса плазмонов.

3

Цель диссертационного исследования

определение

структур

и

исследование РНК-белковых взаимодействий в комплексах рибосомных белков

с РНК с использованием комбинированного структурно-кинетического метода.

Для выполнения данной работы были поставлены следующие задачи:

определение структур рибосомных белков L1 и S8 в свободном

состоянии и в комплексе со специфическими фрагментами РНК;

проведение

сравнительного

структурно-кинетического

анализа

комплексов р-белка L1 и его мутантных форм со специфическими

фрагментами рРНК и мРНК;

исследование роли доменов рибосомного белка L1 в выполнении им

регуляторных свойств и в функционировании рибосомы.

Научная новизна и практическая значимость работы. Объектами исследо-

ваний в данной работе являются бактериальные и архейные р-белки S8 и L1, их

структуры с высоким разрешением были определены в комплексе со

специфическими фрагментами РНК, что позволило детально исследовать РНК-

белковые взаимодействия. Структура комплекса р-белка S8 со специфическим

фрагментом рРНК, определённая с разрешением 2,6Å, была использована для

уточнения

структуры

30S

рибосомной

субчастицы,

определённой

с

разрешением 3Å в группе В. Рамакришнана (Кембридж, Англия). L1-выступ,

вследствие своей подвижности, долгое время не был виден на моделях

рибосомы.

Модель

структуры

изолированного

архейного

р-белка

L1,

определённая в рамках данной работы, была использована в группе Т.Стейца

(Йель, США) для позиционирования в карту электронной плотности большой

рибосомной

субчастицы

галобактериальной

археи.

Структура

реконструированного комплекса L1-рРНК, определённая нами с разрешением

2,65Å, была вписана в модель структуры большой рибосомной субчастицы, что

позволило заполнить пробел в структуре рибосомы. К настоящему времени,

двухдоменный белок L1 — единственный рибосомный белок-регулятор для

которого представлен детальный сравнительный структурно-кинетический

анализ рибосомного и регуляторного комплексов. В наших исследованиях,

проведённых в системах in vitro и in vivo, показана ведущая роль домена I белка

L1 во взаимодействиях белка как с рРНК, так и с мРНК. Полученные

результаты вносят существенный вклад в понимание особенностей структурной

организации рибосомы, а также структурных основ регуляции экспрессии генов

рибосомных белков и могут быть квалифицированы как научное достижение.

4

Поскольку рибосома является мишенью для многих антибиотиков и токсинов,

исследования её структуры имеет не только фундаментальное, но и прикладное

значение.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертационной работы

опубликованы в 26 статьях в российских (6 статей) и международных (20

статей) рецензируемых журналах, представлены на международных и

российских конференциях (25 тезисов): First international workshop on “Structure

research of the ribosome and its functional complexes” (Гестхахт, Германия, 1998),

International conference “The ribosome. Structure, function, antibiotics and cellular

interactions” (Хельсинор, Дания, 1999), RNA Annual Meeting (Берлин, Германия,

2008), 13th

International Conference on the Crystallization of Biological

Macromolecules (Дублин, Ирландия, 2010), 36th FEBS Congress (Турин, Италия,

2011), III Национальной конференции по применению рентгеновского,

синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования

материалов (Москва, Россия, 2001), Международной научной конференции по

биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной

75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова

(Москва, Россия, 2009), Международной Пущинской школы-конференции

молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, Россия, 2004-2009),

Зимней молодёжной научной школе (Пущино, Россия, 2004-2010), International

conference on “Protein biosynthesis, structure and function” (Пущино, Россия,

2007), IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009), V

Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, Россия, 2011).

Личный вклад автора. Результаты работы получены лично автором, под его

руководством или при его непосредственном участии в планировании и

проведении экспериментов. Структуры рибосомных белков и их комплексов с

РНК были определены и проанализированы совместно с группой структурных

исследований рибосомных белков Института белка РАН.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 228 страницах,

состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), результатов исследования и

их обсуждения (2-я глава), описания материалов и методов (3-я глава),

заключения, выводов и списка цитируемой литературы (322 ссылки). Работа

иллюстрирована 103 рисунками и 24 таблицами.

5

Основные результаты исследования, выносимые на защиту.

Высококонсервативные рибосомные белки S8 и L1, пространственная

структура и свойства которых исследованы в данной работе, являются

первично-связывающимися р-белкам, так как они связываются с рибосомными

РНК специфично и независимо от связывания других белков. В E.coli эти р-

белки являются также белками-регуляторами своего собственного синтеза и

синтеза белков, гены которых расположены в том же опероне. Определение

структур этих белков, как в изолированном, так и в связанном с рРНК

состоянии, приведенное в данной работе, способствовало уточнению структуры

рибосомы и детальному исследованию РНК-белковых взаимодействий.

Основное внимание уделено РНК-белковым комплексам, формируемым

белком L1. Сравнительный структурно-кинетический анализ комплексов L1-

рРНК и L1-мРНК позволил определить структурные элементы бактериального

р-белка L1, обеспечивающие регуляторные свойства белка, и влияние

консервативных и неконсервативных взаимодействий на формирование и

стабильность комплексов. Детально исследована роль межмолекулярных

взаимодействий в комплексах, образованных мутантными формами р-белка L1

и РНК. В частности, показано, что РНК-связывающая поверхность белка,

измененная мутацией, при образовании комплекса с РНК может принимать

форму, соответствующую белку дикого типа с сохранением Ван-дер-

Ваальсовых контактов и водородных связей между белком и РНК. В то же

время мутации достаточно сильно уменьшают сродство белка к рРНК, что не

позволяет

использовать

количество

межмолекулярных

контактов

как

единственную величину, характеризующую взаимодействие молекул белка L1

и РНК. Впервые показано, что домен I бактериального р-белка L1 способен in

vitro выполнять регуляторную функцию целого белка и встраиваться в

рибосомы in vivo.

6

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Структура рибосомного белка S8 в комплексе с рРНК

S8 – белок малой рибосомной субчастицы, расположенный на, так

называемой, «платформе» этой субчастицы. Основной участок связывания

белка S8 локализован в центральном домене 16S рРНК вблизи места

сочленения спиралей 20, 21 и 22 (Dean et al., 1981), однако, для специфического

и прочного связывания белка необходим и достаточен фрагмент спирали 21

(Mougel et al., 1993). К концу 90х годов не было модели структуры малой

рибосомной субчастицы с высоким разрешением, поэтому работа по

кристаллизации изолированных р-белков и их комплексов с рРНК была весьма

актуальной. Структура белка S8 из Thermus thermophilus (TthS8) в свободном,

не связанном с РНК состоянии, была определена при участии автора данной

работы. Продолжением этих исследований явилось получение комплексов

этого белка со специфическими фрагментами 16S рРНК, кристаллизация таких

комплексов и определение структуры комплекса, давшего кристаллы самого

высокого качества. Широко известно, что гомологичные р-белки могут

формировать гибридные комплексы с рРНК из различных организмов (Ramirez

et al., 1993), при этом образуются функционирующие рибосомы. Поэтому для

изучения

структуры

комплексов

рибосомных

белков

с

РНК

могут

использоваться

как

гомологические,

так

и

гибридные

РНК-белковые

комплексы. В своей работе для получения комплексов мы использовали р-

белки из термофильных организмов: бактерии (T.thermophilus) и археи

(Methanococcus jannashii). Для того чтобы минимизировать длину фрагмента

рРНК, мы убирали пары нуклеотидов как из верхней части спирали рРНК, так и

из нижней. Было синтезировано и очищено 9 различных фрагментов рРНК из T.

thermophilus и археи M. jannaschii, специфически связывающих белок S8. В

результате был получен минимальный фрагмент спирали 21 рРНК из

T.thermophilus длиной 35 нуклеотидных остатков (н.о.), ещё способный

связываться с белками TthS8 и S8 M. jannashii (MjaS8).

Наилучшие

результаты

были

получены

при

кристаллизации

гомологического S8-РНК комплекса из M. jannaschii, содержащего фрагмент

16S рРНК из M. jannaschii длиной 37 нуклеотидов, структура была определена с

разрешением 2,6Å (рис.1).

7

Рис. 1. а) Кристаллы комплекса MjaS8-рРНК. б) Модель структуры комплекса

белка MjaS8 с фрагментом 16S рРНК из M. jannaschii. в) Схема основной цепи

MjaS8, каждый десятый аминокислотный остаток показан кружком.

Кристаллографическая

структура

показала,

что

37-нуклеотидный

фрагмент 16S рРНК (рис. 2а) представляет собой спираль 21, содержащую

консервативную центральную часть и два расположенных по ее краям

спиральных участка. Нуклеотиды центральной высоко консервативной области

формируют сложную структуру, которая стабилизирована большим числом

водородных

связей

и

стэкинг-взаимодействий.

Показано,

что

MjaS8

взаимодействует с рРНК обоими доменами. Межмолекулярная контактная

область включает два участка, расположенных на малом желобке рРНК на

расстоянии одного витка спирали. Белок MjaS8 при этом играет роль мостика

через глубокий желобок рРНК. Консервативные нуклеотиды центральной части

h21 стабилизируют уникальную трехмерную конформацию сахарофосфатного

остова

РНК,

которая

создает

поверхность,

узнаваемую

белком

S8.

Взаимодействующие участки на белке и РНК имеют высокую степень

комплементарности.

Основной участок взаимодействия MjaS8 с малым желобком 16S рРНК

образован аминокислотными остатками С-концевого домена и Arg36 N-

концевого домена. Имеется сетка из пяти консервативных водородных связей,

большая часть которых сформирована Ser105 и Thr107. Консервативная триада

неполярных аминокислотных остатков С-концевого домена Ser105-Thr106-

Thr107 в белке S8 M. jannaschii локализована в петле между β-слоями и

образует поверхность строго комплементарную поверхности малого желобка

рРНК

в

районе

U641-A642

(рис.2б).

Боковые

цепи

консервативных

треониновых аминокислотных остатков в положениях 106 и 107 образуют

стэкинг-взаимодействия, а Thr106 также стабилизирует поворот β6-β7,

формируя водородные связи с главной цепью Gln108 и Gly109. Сеть

8

Рис. 2. Схематическое изображение третичной структуры 37-нуклеотидного

фрагмента 16S рРНК. а) Красным цветом показаны нуклеотиды, контактиру-

ющие с белком. Если аминокислотный остаток взаимодействует с РНК главной

цепью, контактирующая группа указана в скобках. Большинство атомов глав-

ной цепи и боковых групп MjaS8, взаимодействующих с РНК, лежат в плос-

кости, исключение составляют 3 остатка, которые показаны зеленым цветом.

Неканонические водородные связи между нуклеотидами показаны штриховы-

ми линиями, канонические – сплошными, воббл-пары обозначены кружками.

Линии стэкинг-взаимодействий обозначены серым цветом. б) Фрагмент РНК-

белкового взаимодействия консервативной триады Ser105-Thr106-Thr107 с

динуклеотидной платформой U641-А642. Указаны РНК-белковые контакты и

стэкинг Thr106-Thr107 пептидной связи с основанием А642.

внутримолекулярных водородных связей стабилизирует эту часть структуры

белка, как в свободном состоянии, так и в РНК-белковом комплексе.

Практически все РНК-белковые взаимодействия образованы сахарофосфатным

остовом нуклеотидов рРНК. Единственным специфичным к основанию

взаимодействием в данном комплексе является контакт между высоко

консервативными A642 рРНК и Ser105 белка.

Второй участок РНК-белкового

взаимодействия образован Lys32,

принадлежащим N-концевому домену MjaS8, и сахарофосфатным остовом

нуклеотидов С590 и С591 малого желобка. Наличие этого контакта необходимо

9

для полноценного взаимодействия c РНК, поскольку известно, что укорочение

спирали 21 на несколько пар оснований уменьшает стабильность комплекса.

Специфичность

S8-рРНК

взаимодействий

определяется,

главным

образом,

комплементарностью

поверхностей

РНК

и

белка,

которая

обеспечивается

консервативными

взаимодействиями

белка

с

сахаро-

фосфатным остовом РНК.

Структура комплекса р-белка S8 со специфическим фрагментом рРНК

была в дальнейшем использована для уточнения структуры 30S рибосомной

субчастицы, определённой в 2002 году с разрешением 3Å в группе В.

Рамакришнана (Brodersen et al., 2002).

Мы

провели

сравнительный

анализ

S8-рРНК

взаимодействий

в

определённой нами структуре комплекса MjaS8-16S рРНК и в известных

структурах комплексов, образованных белком S8 в составе 30S рибосомной

субчастицы

и

определили

структурно

консервативный

модуль,

обеспечивающий,

по

всей

видимости,

специфичность

РНК-белковых

взаимодействий. В состав этого модуля входят два строго консервативных

аминокислотных остатка (Ser и Gly), принадлежащие -листу молекулы белка.

Они образуют три межмолекулярные водородные связи, недоступные

растворителю (табл.1).

Таблица 1. Межмолекулярные водородные связи, образованные в структурах как

архейного, так и бактериального комплекса S8-16S рРНК. Жирным шрифтом

выделены консервативные аминокислотные остатки и нуклеотиды.

Комплекс S8 / 16S рРНК из

Комплекс S8/ 16S рРНК 30S

M. jannaschii

субчастицы T. thermophilus

Lys32 N – O1P C590

Arg30 N – O1P C590

Ser105 OG – N3 A642

Ser113 OG – N3 A642

Ser105 OG – O2’ A642

Ser113 OG – O2’ A642

Thr107 OG1 – O2’ A640

Ser115 OG – O2’ A640

Ser115 OG – N3 A640

Gly122 N – O2’ C599

Gly130 N – O2’ C599

Фрагменты -листа, содержащие соответствующие аминокислотные

остатки, сохраняют взаимное пространственное расположение в белках S8,

находящихся как в свободном, так и в связанном состоянии. Стабильность

10

РНК-белкового интерфейса увеличивается за счет гидрофобного окружения и

значительного числа межмолекулярных Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий.

В Escherichia coli белок S8 (EcoS8) является также репрессором

трансляции мРНК spc оперона, несущего гены 11 р-белков. Структура

комплекса EcoS8 cо специфическим фрагментом мРНК была определена в

группе П. Мура (Merianos et al., 2004). Проведённое авторами сравнение с

определённой нами структурой белка MjaS8 показывает, что участок

связывания

на

мРНК,

несмотря

на

отличие

в

нуклеотидной

последовательности, имеет конформационное сходство с участком связывания

белка на рРНК. Эти данные подтверждают важность комплементарности

поверхностей белка и РНК для их взаимного узнавания, так как в рРНК и мРНК

рельеф части поверхности, наиболее приближенной к белку, формируется

сходным образом.

2. Взаимодействия рибосомного белка L1 с РНК

2.1. Конформации рибосомного белка L1

В нашей лаборатории в течение длительного времени ведётся иссле-

дование структуры рибосомного белка L1 и его РНК-связывающих свойств.

Работа началась с исследования свойств и определения структуры р-белка L1 из

термофильной бактерии T.thermophilus (TthL1) (Nikonov et al., 1996). Было

показано, что молекула белка TthL1 состоит из двух структурно различимых

доменов, причем N- и C-концы располагаются в одном домене (домене I). Оба

домена молекулы сближены и имеют необычно малый междоменный контакт с

небольшим количеством слабых взаимодействий (рис 3).

Рис. 3. Модель структуры белка TthL1

11

Такая конформация была названа закрытой конформацией белка L1.

Дальнейшие исследования белка L1 проводились при непосредственном

участии, а, позднее, под руководством автора данной работы. Поскольку L1-

выступ в течение длительного времени не был виден на картах электронной

плотности рибосом и 50S cубчастиц, определение структуры белка L1 и, в

особенности, его комплекса с рРНК было весьма актуальным.

В

рамках

поиска

пригодных

для

рентгеноструктурного

анализа

кристаллов рибосомных белков и их РНК-белковых комплексов были

использованы в качестве источника белков гипертермофильные археи. Мы

получили кристаллы и определили структуру изолированного рибосомного

белка L1 из археи M. jannaschii (MjaL1). Несмотря на подоменное сходство

структур белков TthL1 и MjaL1 (рис. 4а), конформации молекул в целом

Рис. 4. а) Сравнение аминокислотных последовательностей белков TthL1 и

MjaL1. Нумерация показана для TthL1, красными цилиндрами указано

положение α-спиралей, синими стрелками – β-тяжей, области междоменной

перемычка

выделены

прямоугольниками.

б) Кристаллы

MjaL1.

в)

Изображение модели структуры MjaL1.

12

существенно различались. В отличие от бактериального белка TthL1, в

архейном белке MjaL1 домены существенно раздвинуты, молекула имеет, так

называемую, открытую конформацию.

Нами были также получены кристаллы и определена структура

рибосомного

белка

L1

из

другой

археи

рода

Methanococcus

M.thermolithotrophilus (MthL1).

Структура этого архейного р-белка тоже имела открытую конформацию,

стабилизированную водородными связями и солевыми мостиками (рис. 5б).

Рис. 5. а) Кристаллы MthL1. б) Изображение модели структуры белка MthL1.

Таким образом, оба изученных архейных белка L1 имели в свободном

состоянии открытую конформацию. Возник вопрос: является ли закрытая

конформация TthL1 его специфическим свойством или она встречается и в

других бактериальных белках L1. Для ответа на этот вопрос мы определили

структуру бактериального белка L1 – из Aquifex aeolicus (AaeL1). Сравнение

структур TthL1 и AaeL1 показало, что белок AaeL1 действительно имеет

закрытую конформацию, причем в AaeL1 междоменный контакт ещё более

плотный, а конформация более закрытая, чем в TthL1 (рис. 6б).

Рис. 6. а) Кристаллы AaeL1. б) Изображение модели структуры белка AaeL1

(черный цвет), наложенной на структуру белка TthL1 (серый цвет).

13

Отличие в конформации бактериального и архейного белка L1 довольно

значительно. Наложение двух структур по первому домену белка показывает,

что при переходе в открытую конформацию расстояние между строго

консервативными петлями 9-10 первого домена и 5-6 второго домена

увеличивается до 25Å.

Анализ аминокислотных последовательностей белка L1 из различных

организмов, имеющихся в базах данных, показал, что в последовательностях

бактериальных белков в области междоменной перемычки (рис. 4а) имеется

дополнительный аминокислотный остаток. Мы предположили, что именно этот

дополнительный остаток может повысить гибкость перемычки и позволить

бактериальному белку L1 принимать закрытую конформацию. Для проверки

этого предположения мы получили мутантную форму белка TthL1∆A,

лишённую

Ala158,

находящегося

в

дополнительной

позиции,

закристаллизовали мутантную форму и определили её структуру (рис. 7).

Рис. 7. а) Кристаллы TthL1∆А. б) Наложение структур мутантной формы белка

TthL1∆A (синий цвет) на структуру белка дикого типа (жёлтый цвет).

Делеция аланина в междоменной перетяжке белка TthL1 привела к

расхождению доменов белка и к повороту второго домена относительно

первого. Полученная структура мутантной формы белка действительно имеет

открытую

конформацию

(рис.7б).

Поскольку

все

бактериальные

последовательности

L1

имеют

дополнительный

остаток,

повышающий

структурную подвижность в междоменной области, можно предположить, что

преимущественно закрытая конформация свойственна всем бактериальным

белкам L1 в изолированной форме.

14

2.2. Кристаллическая структура L1-выступа

Известно, что рибосомный белок L1 консервативен во всех трёх доменах

жизни. Более того, известно, что бактериальные и архейные белки L1

функционально заменяемы как при функционировании рибосомы (Baier et al.,

1990), так и в репрессии трансляции (Hanner et al., 1994). Это свидетельствует о

консервативности контактирующих поверхностей РНК и белка и позволяет нам

использовать гибридный L1-РНК комплекс для анализа РНК-белковых

взаимодействий. Для кристаллизации мы использовали архейный белок L1 из

Sulfolobus acidocaldarius (SacL1), а специфические фрагменты 23S рРНК как из

T.thermophilus, так и из S.acidocaldarius.

Фрагмент 23S рРНК был выбран на основе работ (Zimmermamm, 1980;

Branlant et., al, 1981), где было показано, что участок 23S рРНК, включающий

части спиралей 76, 78 и спираль 77, в присутствии белка L1 защищается от

воздействия нуклеаз и является минимальным фрагментом, необходимым для

связывания белка L1 (рис. 8).

Рис. 8. Вторичная структура фрагмента 23S рРНК T.thermophilus длиной 55

нуклеотидов (нумерация позиций и спиралей соответствует E.coli). Показаны

спирали и соединяющие их петли А и В.

Поскольку кристаллы архейного рибосомного белка SacL1 в комплексе со

специфическим 55-нуклеотидным фрагментом 23S рРНК из T.thermophilus

(рис. 9а) отражали рентгеновские лучи с высоким разрешением, а кристаллы

комплекса SacL1 соответствующим фрагментом рРНК из S.acidocaldarius были

слишком малы для структурных исследований, мы выбрали для исследований

гибридный комплекс. Структура этого комплекса была определена с

разрешением 2,65Å.

Архейный белок SacL1 в составе комплекса находится в открытой

конформации (рис. 9б), подобной конформациям архейных белков MjaL1 и

MthL1 в свободном состоянии: расстояние между соответствующими строго

15

Рис. 9. а) Кристаллы комплекса SacL1-рРНК. б) Изображение модели SacL1 в

комплексе со специфическим фрагментом 23S рРНК T.thermophilus.

консервативными петлями равно примерно 25Å, как и в архейных белках L1 в

свободном состоянии.

Структура фрагмента рРНК стабилизирована стэкинг-взаимодействиями

(рис. 10) и сетью водородных связей, петли А и В взаимодействуют друг с

Рис. 10. а) Фрагмент 23S рРНК, петля GСАА показана серым. б) Схема

стэкинг-взаимодействий в специфическом фрагменте рРНК. в) Схематическое

изображение участков фрагмента рРНК, образующих водородные связи с

белком.

16

другом, спирали 76 и 77 соединены в одну спиральную структуру и

перпендикулярны Н78.

Рибосомный белок SacL1 взаимодействует с 23S рРНК двумя доменами.

Более 20 аминокислотных остатков домена I вовлечены в РНК-белковые

контакты, тогда как количество остатков домена II в 3 раза меньше (рис. 11а).

Домен I контактирует с 23S рРНК внутренней поверхностью β-листа,

состоящего из тяжей β1, β8, β9, β10 и петлями α1-β1, β7-β8, β9-β10 (рис.11б).

Петли α1-β и β9-β10 содержат аминокислотные остатки, практически

идентичные во всех известных последовательностях белка L1.

Рис. 11. а) Аминокислотная последовательность SacL1. Остатки доменов I и II

показаны светло-голубым и малиновым, соответственно. Аминокислотные

остатки, идентичные в последовательностях бактериального и архейного L1

показаны жёлтым. Аминокислоты, образующие водородные связи с рРНК

выделены прямоугольниками, α-спирали показаны красными циллиндрами, а

β-тяжи – зелёными стрелками. б) Изображение SacL1 в составе модели

комплекса, α-спирали и β-тяжи пронумерованы.

С доменом I взаимодействует малый желобок спирали 77 и одна цепь

H78. Высококонсервативные нуклеотиды G2124, G2125, G2127, C2175

формируют плоскую платформу (рис.10в), которая контактирует со строго

консервативными остатками Phe26, Thr208, Met209 и Gly210. Контакт между

доменом II SacL1 и рРНК сформирован положительно заряженными

аминокислотными остатками спирали α4 и петли α5-β6 со стороны белка и

нуклеотидами G2165-A2171 петли В, имитирующими малый желобок А-

спирали РНК (рис. 10в). Полученная нами структура позволила заполнить

имевшуюся брешь в модели 50S субчастицы рибосомы. Наиболее полно L1-

выступ был представлен в существовавшей в то время модели Tth70S,

определённой с разрешением 5,5Å (Yusupov et al., 2001). Сравнение

17

полученной модели L1-РНК комплекса с соответствующим участком модели

70STth рибосомы показало, что траектория атомов фосфора в спиралях 76 и 77

в

обеих

моделях

очень

схожа.

Это

дало

возможность

наложить

соответствующие участки РНК и встроить нашу модель в структуру 50S

cубчастицы в составе рибосомы T.thermophilus (Tth70S), а также в модель

большой рибосомной субчастицы Deinococcus radiodurans (Dra50S) (рис. 12).

Рис. 12. Вписывание комплекса SacL1-рРНК в модели Dra50S (а) и Tth70S (б).

SacL1 (красный цвет), фрагмент 23S рРНК (синий цвет), 5S рРНК (голубой

цвет), 23S рРНК (зелёный цвет).

Изначально, кристаллы белка TthL1 в комплексе с 55-нуклеотидным

фрагментом 23S рРНК T. thermophilus отражали рентгеновские лучи хуже, чем

кристаллы гибридного комплекса образованного белком SacL1. Чтобы

улучшить качество кристаллов бактериального комплекса, мы варьировали

длину фрагмента РНК. Наилучшие кристаллы (рис.13а) были получены для

комплекса TthL1 с 80-нуклеотидным фрагментом 23S рРНК T. thermophilus,

Рис. 13. а) Кристалл комплекса TthL1-рРНК. б) Изображение модели

комплекса TthL1-рРНК.

18

содержащим полноразмерную спираль 78. Наличие полноразмерной Н78

обеспечило дополнительные РНК-РНК и РНК-белковые контакты, которые

стабилизировали кристаллическую структуру и позволили получить модель

более высокого разрешения. Структура этого комплекса была определена с

высоким разрешением – 2Å, что дало нам уникальную возможность детального

анализа РНК-белковых контактов. Рибосомный белок TthL1 в комплексе с

рРНК имеет открытую конформацию подобную конформации архейных белков

L1,

взаимное

расположение

доменов

было

также

аналогично

взаиморасположению доменов в архейных гомологах (рис. 13б).

Фрагмент 23S рРНК в составе реконструированного полноразмерного L1-

выступа рибосомы включает полные спирали 77 и 78, укороченный вариант

спирали 76, петли А и В на концах спирали 77 и петлю С, замыкающую

спираль 78 (рис.14д).

Петля С, замыкающая спираль 78, находится вблизи средней части

спиралей 76-77. Фосфатные группы U2109 и G2110 проникают в малый

желобок спирали 78 и формируют прямые, а также опосредованные (через

молекулу воды) водородные связи с основаниями и остатками рибозы в

спирали 78.

Наложение модели данной структуры на модель структуры L1-выступа в

составе Tth70S рибосомы с разрешением 3,6Å (Gao et al., 2009) показало, что

r.m.s. отклонение составляет 1,02Å для всех атомов фосфора рРНК, и 0,92Å для

всех Cα атомов молекулы белка, что свидетельствует о том, что структура

комплекса TthL1-рРНК может быть использована для детального анализа РНК-

белковых взаимодействий в L1-выступе рибосомы.

Взаимодействие так же, как в случае SacL1-рРНК, осуществляется двумя

доменами. Со стороны домена I белка TthL1 поверхность контакта

сформирована спиралью 1, которая присутствует лишь в бактериальных р-

белках L1, петлей 2-1, тяжом 1 и петлями 7-8 и 9-10 (рис. 14а). Со

стороны рРНК с белком контактирует практически вся спираль 77, нуклеотиды

2169-2173 петли В (взаимодействие с доменом II белка) и нуклеотиды 2127-

2132 спирали 78 (рис. 14д). Площадь контакта домена II TthL1 с рРНК

значительно меньше, чем в комплексе SacL1-рРНК.

Спираль 78 23S рРНК взаимодействует с N-концевой частью спирали 1

белка, формируя несколько межмолекулярных водородных связей, большая

часть которых доступна растворителю. Основная и наиболее консервативная

19

Рис. 14. Компоненты комплекса TthL1-рРНК. а) Аминокислотная последовательность

белка L1 T. thermophilus. Аминокислотные остатки, входящие в домен I показаны на

розовом фоне, остатки, взаимодействующие с рРНК, помещены в рамку; α-спирали

отмечены красными цилиндрами, β-стрэнды показаны синими стрелками. б) Модель

структуры белка TthL1. в) Изображение комплекса TthL1-рРНК. Белок показан в

малиновом (домен I) и голубом (домен II) цветах, сахаро-фосфатный остов РНК

обозначен оранжевым цветом. г) Третичная структура 80-нуклеотидного фрагмента

23S рРНК T. thermophilus. д) Вторичная структура фрагмента 23S рРНК.

Нуклеотидная последовательность пронумерована в соответствии с нумерацией E.

coli 23S рРНК. Нуклеотиды, взаимодействующие с белком TthL1, помещены в рамку.

часть поверхности РНК-белкового взаимодействия сформирована -листом

TthL1, с принадлежащими ему петлями, и спиралью 77 23S рРНК. Данная

область

контактирующей

поверхности

комплекса

стабилизирована

недоступными для растворителя межмолекулярными водородными связями

(табл. 2). Три из них образованы основаниями нуклеотидов и, по-видимому,

зависят от последовательности нуклеотидов рРНК. Все эти связи присутствуют

и в SacL1-рРНК комплексе. Пять из восьми консервативных водородных связей

образованы

строго

консервативной

триадой

Thr217-Met218-Gly219

с

преобладающим вкладом Thr217.

20

Длина связи, (Å)

3,09

2,68

2,92

2,77

3,13

3,28

3,21

2,64

L1-РНК водородная связь

Glu42 OE1-N2 G2123

Glu42 OE2-O2’ G2124

Asp166 OD2-N2 G2121

Thr217 OG1-O2’ G2124

Thr217 O-N2 G2124

Thr217 O-O2’ C2175

Met218 SD-O2’ C2174

Gly219 O-O2’ C2175

2.3. Кристаллические структуры комплекса рибосомного белка L1 со

специфическими фрагментами мРНК разной длины

Известно, что рибосомный белок L1 в клетке является не только

составной частью L1-выступа, но и регулятором трансляции белков своего

оперона по принципу обратной связи. При недостатке рибосомной 23S РНК

белок

L1

специфически

связывается

с

определенным

участком

в

последовательности своей мРНК и мешает ее трансляции.

Наиболее подробно изучена регуляция L11 оперона E. coli (Gourse et al.,

1986) и L1 оперона архей рода Methanococcus (Köhrer et al., 1998; Hanner et al.,

1994). В E. coli белок L1 связывается с участком перед первым геном L11

оперона, а в археях M.vannielii и M.jannashii регуляторный участок на мРНК

располагается в начале кодирующей последовательности первого гена L1

оперона. Участки связывания белка L1 на мРНК и рРНК похожи по первичной

и по вторичной структуре (рис. 15). Для того чтобы исследовать структурную

основу

регуляторных

свойств

рибосомного

белка

L1,

необходим

сравнительный анализ структур комплексов: L1-рРНК и L1-мРНК. Мы провели

поиск оптимальных фрагментов мРНК для кристаллизации комплекса L1-

мРНК. Для получения кристаллизуемого препарата комплекса L1-мРНК была

применена та же стратегия, что использовалась ранее при получении препарата

комплекса S8-рРНК.

В группе В.Пиндла (Инсбрук, Австрия) был определён минимальный

фрагмент мРНК M.vannielii (мРНКMva), так называемый, cтартовый фрагмент,

21

Таблица 2. Длина консервативных L1-рРНК водородных связей в комплексе TthL1-

рРНК. Жирным шрифтом выделены связи, образованные основаниями нуклеотидов.

Рис. 15. Вторичная структура участка связывания белка L1 на 23S рРНК

(слева) и мРНК (справа). Консервативные нуклеотиды зачернены.

необходимый и достаточный для взаимодействия с белком L1. Для того чтобы

получить подходящие пригодные для рентгеноструктурного анализа кристаллы

регуляторного комплекса белка L1, мы провели серию экспериментов по

дизайну и синтезу фрагментов мРНК. Менялась длина и нуклеотидный состав

двух

спиралей,

фланкирующих

ассиметричную

петлю,

содержащую

консервативные нуклеотиды. Были получены 10 фрагментов мРНК длиной от

36 до 49 нуклеотидов, специфически связывающихся с белком L1. Семь

фрагментов

представляли

собой

различные

вариации

специфического

фрагмента мРНКMva, а три – различные специфические фрагменты мРНК M.

jannaschii (мРНКMja).

Были получены различные кристаллы комплексов таких фрагментов

мРНК, содержащих TthL1 или MjaL1. Нам удалось определить структуры трёх

комплексов. Первой была определена структура гомологического комплекса

MjaL1 cо специфическим фрагментом мРНКMja длиной 49 нуклеотидов с

разрешением 3,4Å. Автором данной работы были получены достаточно

упорядоченные кристаллы комплекса MjaL1-мРНКMja, с которых был собран

набор дифракционных данных и методом мультимноговолновой аномальной

дисперсии определена структура комплекса с разрешением 3,4 Ǻ (рис. 16).

Структура белка MjaL1 в составе комплекса была близка к структуре

белка в свободном состоянии. В обоих случаях белок находился в открытой

конформации,

структура

его

доменов

не

претерпевала

существенных

конформационных изменений. MjaL1 взаимодействует с мРНК, в основном, за

счет аминокислотных остатков домена I. Фрагмент мРНК представляет собой

две регулярные спирали, образующие друг с другом практически прямой угол

(рис. 17a). Рибозо-фосфатные группы нуклеотидов G37 и C63 сближены, а

фосфатные группы нуклеотидов G34, C38 и U65, C66 располагаются примерно

22

Рис. 16. а) Кристаллы комплекса MjaL1-мРНК. б) Изображение модели

комплекса MjaL1-мРНК.

в одной плоскости и окружают немного вогнутый участок, за счет которого

мРНК, в основном, взаимодействует с белком L1. Поверхность нижней спирали

фрагмента мРНК комплементарна поверхности β-листа домена I белка L1.

Наши

дальнейшие

исследования

были

посвящены

исследованию

принципов взаимодействия р-белка L1 в рибосомном и регуляторном

комплексах. Сравнение структур определённого на тот момент рибосомного

(SacL1-рРНК) и регуляторного комплексов белка MjaL1 показало, что белок

образует сеть недоступных растворителю водородных связей со структурно

инвариантным мотивом, расположенным в месте сочленения двух спиралей,

как на мРНК, так и на рРНК, и содержащим строго консервативные нуклеотиды

(рис.17б). Анализ пространственных структур белков L1 в свободном и в

связанном с РНК состояниях позволил выделить на поверхности белка участок,

структура

которого

инвариантна

во

всех

известных

молекулах

L1:

расположенные рядом петли в домене I - РНК-связывающий модуль (рис.17в).

В отличие от рибосомной РНК длиной 55 н.о., матричная РНК не

содержит участок, образованный контактирующими между собой длинными

петлями (А и В). В рибосомном комплексе этот участок взаимодействует с

кластером

консервативных

аминокислотных

остатков

домена

II.

Аминокислотные остатки РНК-связывающего модуля MjaL1 (Ser25, Glu27,

Thr204, Met205) образовывают недоступные для растворителя водородные

связи с нуклеотидами G33, G34, C63 мРНК.

К

сожалению,

низкое

разрешение

полученной

нами

структуры

регуляторного комплекса (3,4Å) не позволило провести детальный анализ РНК-

белковых взаимодействий в регуляторном комплексе. Поиски оптимального

для кристаллизации комплекса L1-мРНК были продолжены. Автором данной

23

работы были получены упорядоченные кристаллы комплекса белка TthL1 с

короткими фрагментами мРНК M.vannielii (38 и 36 н.о.), отражавшие

рентгеновские лучи до 2,6 и 2,1Å соответственно.

Рис. 17.

а)

Схема

трёхмерных

структур

фрагментов

мРНКMja

и

рРНКTth.Замены нуклеотидов, которые были введены во фрагменты РНК,

чтобы

облегчить

кристаллизацию

комплекса,

показаны

курсивом.

Нуклеотиды, принимающие участие в РНК-белковых водородных связях,

показаны на голубом фоне, нуклеотиды, которые наиболее критичны для

взаимодействия с белком, показаны на жёлтом фоне. б) Наложение

структурно-консервативных участков специфических фрагментов рРНК

(зелёный) и мРНК (синий). Уникальная консервативная структура выделена

светло-жёлтым цветом. в) Структурно инвариантный участок в белке MjaL1.

Справа – локализация РНК-связывающего модуля на модели MjaL1 (показано

зелёным), слева – наложение соответствующих областей белка L1 в

изолированном и РНК-связанном состоянии.

24

Белок TthL1 в связанном с мРНК состоянии имеет открытую

конформацию. Кристаллы комплекса белка

TthL1 с 38-нуклеотидным

фрагментом мРНК содержат в независимой части элементарной ячейки 4

близкие по структуре, но не идентичные копии.

Взаимодействие между белком и мРНК осуществляется, в основном,

через его домен I, домен II практически не взаимодействует с мРНК (рис. 18).

Принадлежащий домену II аминокислотный остаток Arg134 и находящийся в

перемычке между доменами Lys70 вовлечены в образование водородных связей

лишь в двух из четырёх копий комплекса в элементарной ячейке.

Рис. 18. Изображение модели структуры комплекса TthL1 с фрагментом

мРНК из M. vannielii.

РНК-белковые взаимодействия осуществляются, главным образом, через

сахарофосфатный остов фрагмента мРНК, и лишь две водородные связи,

сформированные N2 атомами G30 и G33, образованы основаниями. Можно

выделить два кластера РНК-белковых взаимодействий. Первый кластер

находится во всех четырёх копиях TthL1-мРНК и располагается на домене I

(Phe37, Thr40, Glu42, Thr217, Met218 и Gly219). Второй кластер (Gly132,

Pro133, Arg134, Gly135) принадлежит домену II и контактирует с мРНК через

Arg134 в двух копиях комплекса, в которых открытие междоменной полости

менее 20,5Å. В других двух копиях такое взаимодействие отсутствует.

Ключевую роль во взаимодействии рибосомного белка TthL1 с мРНК,

также как и с рРНК, играют консервативные недоступные для растворителя

водородные связи, образованные консервативной триадой Thr217-Met218-

Gly219, расположенной в домене I белка (рис. 19).

Интересно,

что

структура

поверхности

РНК-белкового

контакта,

формируемая внутренней поверхностью -листа и смежными петлями домена I

25

Рис. 19. Консервативные недоступные для растворителя водородные связи,

образованные триадой Thr-Met-Gly.

белка TthL1, идентична в его комплексах с мРНК и с рРНК. Тем не менее, как

известно, р-белок L1 имеет различное сродство к фрагментам рРНК и мРНК и

осуществляет регуляцию по принципу «обратной связи».

Какие же РНК-белковые взаимодействия обеспечивают регуляторные

свойства белка L1?

2.4. Структурно-кинетический анализ взаимодействий рибосомного

белка TthL1 и его мутантных форм c мРНК и рРНК

2.4.1. РНК-белковые взаимодействия, обеспечивающие регуляторные

свойства белка TthL1

Для

исследования

особенностей

взаимодействия

белка

L1

со

специфическими фрагментами мРНК и рРНК мы применили комбинированный

структурно-кинетический

подход.

Метод

поверхностного

плазмонного

резонанса (ППР) позволяет наблюдать взаимодействие молекул в реальном

времени. Для кинетического анализа мы использовали биотинилированные

специфические фрагменты РНК: мРНК M.jannaschii длиной 48 н.о. и рРНК

T.thermophilus длиной 55 и 80 нуклеотидов (рис. 20), «пришитые» к сенсорным

NLS чипам с иммобилизованным авидином.

Мы показали, что, несмотря на то, что площадь РНК-белкового контакта

в структурах комплексов белка TthL1 c фрагментами рРНК длиной 55 н.о. и 80

н.о. отличается незначительно, сродство белка к рРНК в отсутствие

полноразмерной H78 (55-нуклеотидный фрагмент) падает в 50 раз (табл. 3).

26

контактирующей

поверхности,Å2

1466

1405

1256

скорости

скорости

константа

РНК

80 н.о. 23S рРНК

55 н.о. 23S рРНК

ассоциации ka

диссоциации

(1×104 1/Ms)

kd (1×10-4 1/s)

диссоциации

KD (нМ)

0,002

0,090

85,000

56,400

20,300

0,012

0,180

5,190

Рис. 20. Фрагменты РНК, специфически взаимодействующие с белком L1. а)

80-нуклеотидный фрагмент рРНК. б) 55-нуклеотидный фрагмент рРНК. в)

Фрагмент

мРНК.

Рамкой

выделены

нуклеотиды,

участвующие

в

формировании консервативных контактов с белком L1.

Таблица 3. Кинетические константы взаимодействия белка TthL1 со специфическими

фрагментами мРНК и рРНК.

Константа

Константа

Равновесная

Площадь

48 н.о. мРНК

0,600

Cпецифический

фрагмент

мРНК

отличается

от

специфического

фрагмента рРНК в участках, соответствующих спирали 78 и петле В

рибосомной РНК (рис. 20) В результате, сродство TthL1 к мРНК падает почти

на 3 порядка по сравнению с комплексом L1-рРНК 55 н.о. (табл. 3). Таким

образом, структурные особенности участка мРНК обусловливают регуляторные

свойства белка L1.

Какие же структурные элементы бактериального белка L1 увеличивают

его сродство к рибосомной РНК?

Основная консервативная область контакта бактериального рибосомного

белка TthL1 расположена на его домене I и может быть разделена на два

участка: один из них включает консервативную триаду Thr217, Met218, Gly219,

образующую закрытые от растворителя водородные связи с нуклеотидами

27

спирали 77, другой — N-концевую часть спирали 1, взаимодействующую с

нуклеотидами Н78. В комплексе с мРНК первый участок взаимодействия

содержит те же консервативные водородные связи, однако количество

неконсервативных контактов уменьшается, что уменьшает сродство белка к

мРНК по сравнению с рРНК. То же самое происходит и во втором участке

связывания:

большее

число

взаимодействий

между

аминокислотными

остатками N-концевой спирали и фрагментом рРНК также значительно

увеличивают сродство бактериального рибосомного белка L1 к рРНК по

сравнению с его сродством к мРНК.

Кроме вышеперечисленных взаимодействий домена I с РНК, в

рибосомном

комплексе

имеются

взаимодействия

рРНК

с

аминокислотными остатками домена II, что также увеличивает стабильность

рибосомного комплекса.

Поскольку основной консервативный участок взаимодействия с мРНК и

рРНК находится на домене I белка TthL1 (петля β9-β10), а домен II не участвует

во взаимодействии с мРНК, мы предположили, что домен I необходим и

достаточен для взаимодействия полноразмерного белка как с мРНК, так и с

рРНК.

Мы

провели

структурно-кинетический

анализ

РНК-белковых

взаимодействий

в

комплексах

изолированного

домена

I

TthL1

специфическими фрагментами РНК.

2.4.2. Домен I рибосомного белка L1

Домен II р-белка L1 представляет собой вставку в домен I. Анализ

структуры TthL1 в связанном с РНК состоянии показал, что два глицина (Gly67

и Gly159) расположены в противоположно направленных цепях междоменной

перемычки белка на расстоянии 4Å, что позволяет сформировать пептидную

связь между ними при удалении аминокислотной последовательности,

соответствующей второму домену. Мы получили генетическую конструкцию,

несущую ген домена I TthL1 (TthL1dI), кодирующую аминокислотные остатки

1-67 и 159-228, выделили белок, закристаллизовали и определили структуру c

разрешением 2,3Å (рис 21). Анализ кристаллической структуры показал, что

пространственная укладка цепи в изолированном домене и в том же домене в

составе целого белка практически полностью совпадает (рис. 21б).

28

ассоциации ka

диссоциации kd

диссоциации KD

(1×104 1/Ms)

(1×10-4 1/s)

(нМ)

Белок

мРНК

рРНК

мРНК

рРНК

мРНК

рРНК

TthL1

5,900

56,400

1,000

0,012

1,800

0,002

TthL1dI

18,000

163,000

15,000

0,079

8,400

0,005

Константа скорости ассоциации (ka) TthL1dI c РНК выше, чем ka

комплекса, образованного полноразмерным белком. Вероятно, избыточная

подвижность домена II создаёт некоторые стерические затруднения на первых

этапах формирования комплекса.

Для проверки соответствия структур РНК-белковых интерфейсов в

комплексах TthL1dI и полноразмерного белка TthL1 c РНК, мы получили

29

Рис. 21. Домен I TthL1. а) Кристалл TthL1dI. б) Наложение структуры

изолированного TthL1dI (голубой цвет) на структуру первого домена в

составе целого белка TthL1 (красный цвет). Жёлтым цветом показан домен II.

в) Изображение модели структуры TthL1dI.

Небольшие изменения наблюдаются лишь в области подвижных петель в

районах кристаллических контактов. Сродство белков TthL1 и TthL1dI к РНК

было тестировано методами «гель-шифта» и ППР. Было показано, что сродство

домена I к рРНК (80-нуклеотидный специфический фрагмент 23S рРНК), на

несколько порядков выше, чем его сродство к мРНК (табл. 4). Исходя из этого,

мы предположили, что домен I мог бы, также как полноразмерный белок,

обладать регуляторной функцией.

Таблица 4.

Кинетические

константы

взаимодействия

белков

TthL1

и

со

специфическими фрагментами мРНК и рРНК.

Константа скорости

Константа скорости

Равновесная константа

кристаллы

комплекса

TthL1dI

со

специфическим

фрагментом

мРНК

M.jannaschii длиной 48 н.о и определили структуру комплекса с разрешением

2,3Å (рис. 22).

Рис. 22. IdTthL1-мРНК. а) Кристаллы TthL1dI-мРНК. б) Изображение модели

структуры комплекса TthL1dI-мРНК.

Область РНК-белкового интерфейса в комплексе TthL1dI-мРНК не

отличалась

от

интерфейса

в

комплексе

TthL1-мРНК,

следовательно,

взаимодействие изолированного домена I с РНК происходит так же, как в

составе целого белка.

Для детального анализа принципов РНК-белкового взаимодействия мы

провели мутационный анализ консервативных аминокислотных остатков

триады Thr217-Met218-Gly219, расположенных в петле 9-10 домена I. На

долю аминокислотных остатков триады (площадь контакта составляет 11% от

общей площади интерфейса) приходится около 20% всех взаимодействий с

РНК

и

половина

всех

недоступных

растворителю

межмолекулярных

водородных связей. Все мутантные формы белка L1 были закристаллизованы в

свободном состоянии и большинство из них — в комплексе со специфическим

80-нуклеотидным фрагментом рРНК. Структуры определены с высоким

разрешением. С помощью метода ППР мы определили кинетические константы

взаимодействия данных мутантных форм белка с мРНК и рРНК.

2.4.3. Замены Thr217 в белке TthL1 на аланин и валин

Треонин в позиции 217 образует 40% всех контактов с РНК,

формируемых консервативной триадой. Для того чтобы исследовать роль этого

важного аминокислотного остатка во взаимодействии белка L1 с рРНК мы

провели структурно-кинетический анализ комплексов мутантных форм белка

Thr217Val TthL1 и Thr217Ala TthL1 c 80-ти нуклеотидным фрагментом рРНК.

Гидроксил боковой цепи и карбонильная группа главной цепи треонина

30

формируют недоступные для растворителя межмолекулярные водородные

связи. Мы предположили, что, поскольку замена треонина на другой

аминокислотный остаток приводит к потере одной водородной связи, мы

сможем оценить её влияние на стабильность РНК-белкового комплекса.

Мы

получили

мутантную

форму

Thr217Ala

TthL1,

белок

был

закристаллизован структура определена с разрешением 1,46Å. В структуре

Thr217Ala TthL1 на месте атомов O1 и C2 треонина 217 оказались две

молекулы ассоциированной воды (рис. 23а). Эти молекулы воды сформировали

сеть из четырёх водородных связей, стабилизирующих РНК-связывающую

область белка. По всей видимости, именно проникновение молекул воды в

структуру белка привело к сдвигу Сα атомов Ala217 и Met218 приблизительно

на 1 и 2Å соответственно, а Сβ атома Ala217 на 2Å (рис. 23а), что сформировало

выступ на РНК-белковом интерфейсе.

Автором данной работы были получены кристаллы комплекса Thr217Ala

TthL1 со специфическим фрагментом рРНК (рис. 23в). Оказалось, что в РНК-

белковом интерфейсе отсутствуют молекулы ассоциированной воды вблизи

места мутации на белке и нет заметного искажения конформации РНК-

связывающего участка (рис. 23б). Структура домена I в мутантном комплексе

Thr217Ala TthL1-рРНК очень схожа с его структурой в составе комплекса белка

TthL1 дикого типа с РНК. Взаимное положение спирали 77 рРНК и домена I

аналогично их положению в структуре комплекса, образованного белком

дикого типа. Для дальнейшего выяснения роли межмолекулярных водородных

связей, формируемых Thr217, мы получили и закристаллизовали мутантную

Рис. 23. Наложение областей РНК-белковых контактов в структуре TthL1 (С-

атомы показаны серым) и Thr217Ala TthL1 (С-атомы показаны зелёным) в

свободном состоянии (а) и связанном с рРНК (б). в) Кристалл комплекса

Thr217Ala TthL1 со специфическим фрагментом рРНК.

31

форму TthL1 с заменой Thr217Val.

В свободном белке дикого типа Thr217 образует внутримолекулярную

водородную связь с атомом азота главной цепи Thr40 (рис. 24а) и формирует

короткую (2,4Å) водородную связь с кислородом основной цепи Pro133,

принадлежащего домену II. Взаимное расположение петли 9-10, спирали 1

и

петли

2-1

стабилизировано

сетью

водородных

связей.

Замена

гидроксильной группы Thr217 на метильную группу валина приводит к сдвигу

петли, содержащей Thr217 (9-10), в направлении Met218 примерно на 1Å,

формируя выступ на поверхности белка (рис. 24а). В результате петля 9-10

меняет своё положение относительно петли 2-1 и водородные связи между

ними, образованные через остаток Glu39 рвутся. Сам аминокислотный остаток

Glu39 становится доступен растворителю и петля 2-1, содержащая

консервативный

Phe37,

важный

для

связывания

с

РНК

приобретает

дополнительную подвижность. Для того чтобы выяснить как повлияла

указанная замена на взаимное положение белка и РНК в комплексе, мы

определили кристаллическую структуру Thr217Val TthL1 в комплексе с 80

нуклеотидным фрагментом 23S рРНК. При сравнении этой структуры со

структурой комплекса, образованной белком дикого типа, видно лишь

небольшое отличие в положении домена II относительно домена I. Выступ на

поверхности РНК-связывающего участка мутантного белка отсутствовал и

петли 9-10 и 2-1 занимали то же положение, что в белке дикого типа,

связанном с рРНК (рис. 24б).

Рис. 24. Наложение областей РНК-белкового контакта в TthL1 дикого типа

(C- атомы показаны серым) и мутантной форме Thr217Val TthL1 (С-атомы

показаны зелёным): а) белки в свободной форме, б) белки в комплексе с

рРНК. в) Кристаллы комплекса Thr217Val TthL1– рРНК.

32

Домен I и спираль 77 ведут себя как твердое тело, идентично тому, как

это имеет место в комплексе РНК с белком дикого типа.

2.4.4. Замена Met218 в белке TthL1 на лейцин

Для дальнейших исследований роли консервативной триады в РНК-

белковых взаимодействиях мы заменили ее второй аминокислотный остаток

(метионин) на лейцин, получили мутантную форму Met218Leu TthL1,

закристаллизовали и определили ее структуру с разрешением 2Å. Кристаллы

M218LTthL1 имели очень плотную упаковку, что привело к уменьшению

расстояния между петлями 7-8 и 9-10, окружающими Н77 рРНК в

структурах РНК-белковых комплексов. В области мутации боковые цепи Phe37

и Leu218 формируют гидрофобное пятно на поверхности белка. В результате

чего, этот участок изменяет свойства РНК-связывающего модуля на мутантном

белке по сравнению с белком дикого типа. В результате мутации разрывается

водородная связь, сформированная Glu39 c основной цепью Met218 и боковой

цепью Thr217 (рис. 25а), что может быть причиной движения петель 2-1 и

9-10.

Следуя процедуре, описанной при исследовании влияния предыдущих

мутаций,

мы

закристаллизовали

Met218Leu

TthL1

в

комплексе

со

специфическим фрагментом рРНК (80 н.о,) и определили структуру данного

комплекса с разрешением 1,9Å (рис. 25б, в). Структура комплекса рРНК с

Рис. 25. Наложение области РНК-белкового контакта TthL1 (C-атомы серые) и

мутантной формы Met218Leu TthL1 (С-атомы жёлтые) в свободной форме (а) и в

комплексе с РНК (б). в) Кристаллы комплекса Met218Leu TthL1 – рРНК.

33

данным мутантным белком была также очень похожа на структуру комплекса с

белком дикого типа. Боковая цепь Leu218 хорошо совпадала с боковой цепью

Met218 в белке дикого типа. Атом Сδ2 Leu218 занимал позицию Sδ атома

метионина и был способен образовать C-H…O связь с С2174.

2.4.5. Замена Gly219 в белке TthL1 на валин

Анализ роли аминокислотных остатков консервативной триады был

завершён заменой глицина в положении 219 на валин. Мутантный белок

Gly219Val TthL1 был закристаллизован как в свободной форме, так и в

комплексе с рРНК (рис. 26).

В свободной форме белка введение Val219 в гидрофобное ядро,

сформированное Val14, Val29, Leu32 и Val222 приводит к значительным

изменениям не только в положении петли 9-10, но и в её конформации

(рис. 26а). Атом серы боковой цепи Met218 сдвигается примерно на 7Å

относительно позиции в белке дикого типа, а Pro220 смещается примерно на 3Å

и формирует выступ (3Å) на поверхности белка, препятствующий образованию

межмолекулярных РНК-белковых связей. Было бы логично предположить, что

данная мутантная форма белка будет неспособна формировать специфические

РНК-белковые взаимодействия. Тем не менее, мы получили комплекс

Gly219Val TthL1-рРНК и определили его структуру с разрешением 2Å.

Удивительно, что все межмолекулярные водородные связи сохранились, а

Рис. 26. Наложение области РНК-белкового контакта TthL1 (С-атомы серые)

и мутантной формы TthL1 Gly219Val (С-атомы фиолетовые) в свободной

форме (а) и в комплексе с РНК (б). в) Кристаллы комплекса TthL1 Gly219Val-

рРНК.

34

структура

РНК-белкового

интерфейса

в

данном

комплексе

оказалась

идентичной структуре в комплексе РНК и белка дикого типа, аналогично

комплексам, образованным другими исследованными мутантными формами

консервативной триады TthL1. Домен II в комплексе Gly219Val TthL1-рРНК

занимает практически такую же позицию, как и в комплексе TthL1-рРНК.

Некоторая подвижность присуща лишь области 4-5 домена II, содержащей

β4 стрэнд. Взаимное положение первого домена белка и спирали 77 рРНК не

меняется по сравнению с комплексом, образованным белком дикого типа.

На основании анализа структур РНК-белковых комплексов, образованных

как белком дикого типа, так и его мутантными формами можно заключить, что

первый домен белка TthL1 и спираль 77 23S рРНК образуют твердое тело,

которое не разрушается в результате мутаций. В специфических комплексах

TthL1-рРНК другое взаимное положение этих элементов белка и рРНК

невозможно, хотя незначительные подвижки домена II и спиралей 76 и 78

допустимы. Взаимодействия между доменом I и спиралью 77 стабилизируют

ядро данного РНК-белкового комплекса.

Во всех описанных мутантных формах белка TthL1 в их свободном

состоянии замены приводят к изменению конформации петли 9-10 и её

положения относительно области 7-8. В этих же мутантных белках,

связанных

с

РНК,

данные

замены

приводят

лишь

к

изменениям

непосредственно в точке мутации, тогда как конформация главной цепи

остается идентичной таковой в комплексе с белком дикого типа. Во всех

Таблица 5. Статистический анализ L1-рРНК взаимодействий с длиной связи 2,6-4,0Å.

L1-рРНК

Количество Среднее

Количество

Количество

комплекс

контактов

расстояние водородных водородных

L1-РНК

связей

связей,

(Å)

недоступных

растворителю

KD (KM),

M

2,1410-12

1,4410-10

9,7910-10

1,8710-8

1,4810-7

TthL1-РНК

T217A TthL1-

РНК

T217V TthL1-

РНК

G219V TthL1-

РНК

M218L TthL1-

РНК

244

3,586

20

6

267

3,614

18

5

262

3,585

19

5

232

3,601

18

6

239

3,620

19

6

35

случаях комплексы стабилизированы водородными связями и ван-дер-

ваальсовыми контактами. Общее количество РНК-белковых контактов и

средние РНК-белковые расстояния в интервале 2,6-4,0Å, а также количество

консервативных водородных связей в комплексах мутантных белков с РНК и в

комплексах белка дикого типа практически одинаково (табл. 5). Поэтому

уменьшение сродства мутантных белков к РНК не может быть объяснено

только наблюдаемыми изменениями в структурах комплексов.

2.4.6. Кинетический анализ взаимодействий мутантных форм TthL1 со

специфическим фрагментом рРНК

Для того чтобы детально исследовать механизм взаимодействия

мутантных форм TthL1 cо специфическим фрагменом рРНК, мы провели

кинетический анализ РНК-белковых взаимодействий методом ППР. Были

получены сенсограммы, демонстрирующие взаимодействия белка TthL1 и его

мутантных форм с 80-ти нуклеотидным фрагментом 23S рРНК. Вначале мы

обрабатывали

все

эти

экспериментальные

кривые

с

использованием

одностадийной модели взаимодействия. В результате, было получено очень

хорошее

приближение

(2 2,5)

для

РНК-белковых

комплексов,

сформированных белком дикого типа и мутантными формами TthL1 с

заменами Thr217, однако, сенсограмма взаимодействий Gly219Val TthL1 с

фрагментом рРНК обрабатывалась с использованием такой модели значительно

хуже (2 = 5,6) (табл.6). Для того чтобы получить лучшее приближение

теоретической кривой к экспериментальной, мы использовали двустадийную

модель реакции. В этой модели два компонента формируют промежуточный

комплекс с константами скорости ассоциации и диссоциации (ka1 и kd1) и

конечный комплекс с константами ka2 и kd2. По-видимому, формирование

промежуточного комплекса является быстрым процессом, за которым следует

медленный

переход

в

конечный

комплекс,

схожий

с

комплексом,

сформированным белком дикого типа (табл. 6).

Двустадийная модель улучшает приближение для комплекса Gly219Val

TthL1-рРНК (2 = 1.9) и Met218Leu TthL1-рРНК (2 = 1,78) (табл.6).

Все исследованные мутантные формы белка L1 имеют пониженное

сродство к рибосомной РНК. В РНК-белковых комплексах, сформированных

мутантными формами TthL1 с заменами Thr217Ala и Thr217Val, отсутствует

одна консервативная недоступная для растворителя водородная связь. В

36

результате, константы скорости диссоциации РНК-белковых комплексов

мутантных

белков

по

сравнению

с

комплексом

белка

дикого

типа

увеличиваются в 31 и 231 раз для Thr217Ala TthL1 и Thr217Val TthL1,

соответственно (табл. 6). Возможно, значительное уменьшение стабильности

комплекса Thr217Val ТthL1-рРНК связано со структурными напряжениями,

возникшими в результате соответствующей замены в области РНК-белкового

интерфейса.

В комплексе, сформированном мутантной формой Gly219Val ТthL1, все

консервативные недоступные растворителю водородные связи сохраняются,

однако, по всей видимости, необходимость адаптации структуры белка к РНК

значительно уменьшает скорость формирования конечного комплекса.

Взаимодействия при образовании комплекса Met218Leu ТthL1-рРНК

ослаблены на несколько порядков и хорошо описываются двухстадийной

Таблица 6. Кинетические параметры взаимодействия TthL1 и его мутантных форм со

специфическим фрагментом 23S рРНК (80 н.о.) KD = kd1/ka1; KM = (kd1+ka2)/ka1.

ka1, M-1s-1

5,64105

2,64105

1,68105

2,86105

1,66105

8,37x105

3,75106

1,76105

6,57 104

4,28103

kd1, s-1

ka2, s-1

kd2, s-1

KD, M

KM, M

χ2

Белок

Модель

реакции

Дикий

1

тип

стадия

1,2110-6

3,8010-5

7,5710-6

2,8010-4

5,2710-6

1,68x10-3

9,3410-3

1,3810-6

2,0410-3

8,3510-7

2,1410-12

1,4410-10

2,7810-5 1,2110-5

9,7910-10

2,5710-4 4,4210-5

2,01x10-9

2,4910-9

3,3010-3 2,4610-4

3,1010-8

6,3410-4 3,1010-5

37

2.07

2,11

2,29

2,30

1,91

2,47

5,59

1,91

4,50

1,78

TthL1

T217A

TthL1

T217A

TthL1

T217V

TthL1

T217V

TthL1

T217V

TthL1dI

G219V

TthL1

G219V

TthL1

M218L

TthL1

M218L

TthL1

1

стадия

2

стадии

1

стадия

2

стадии

1

стадия

1

стадия

2

стадии

1

стадия

2

стадии

2,1010-10

1,5810-9

1,8710-8

1,4810-7

моделью (табл. 6). Также как в случае белка Gly219Val ТthL1, РНК-

связывающая область в белке Met218Leu ТthL1 в свободном состоянии

искажена и, соответственно, формирование конечного комплекса с РНК

проходит через длительную «притирку» поверхности мутантного белка к РНК,

включающую образование и распад промежуточного комплекса.

Совместный

анализ

структурных

и

кинетических

данных,

характеризующих комплексы белка ТthL1 и его мутантных форм с

фрагментами 23SрРНК, показывает отсутствие корреляции между числом

межмолекулярных водородных связей или ван-дер-Ваальсовых контактов и

сродством белка к РНК (табл. 5, 6). Исходя из этого, можно утверждать, что

подсчет межмолекулярных контактов не дает полного представления об РНК-

белковых взаимодействиях, во всяком случае, при образовании комплексов

мутантных форм TthL1 с РНК.

По сравнению с влиянием на сродство к рРНК замены аминокислотных

остатков консервативной триады намного сильнее влияют на сродство белка L1

к мРНК: во всех исследованных случаях мы не наблюдали комплексов этих

мутантных форм со специфическим фрагментом мРНК. Это связано со

структурными особенностями специфического участка связывания белка на

мРНК,

так

как

в

нём

отсутствует

ряд

структурных

элементов,

взаимодействующих с белком в случае рРНК (см. раздел 2.4.1.), сродство белка

дикого типа к мРНК ниже, чем к рРНК, поэтому потеря всего одной закрытой

от растворителя водородной связи между белком и РНК (Thr217Ala и

Thr217Val) либо деформация области РНК-белкового контакта (Met218Leu,

Gly219Val) приводит к полной дестабилизации L1-мРНК комплексов.

2.5. Исследование свойств домена I рибосомного белка L1: регуляция

экспрессии L1-оперона и встраивание в рибосому

Анализ TthL1-РНК структур показал, что основные детерминанты для

взаимодействия белка L1 с РНК находятся в его домене I. Кинетический анализ

взаимодействия TthL1dI со специфическими фрагментами мРНК и рРНК

свидетельствует, что, также как для целого белка TthL1, сродство домена I к

рРНК на несколько порядков выше, чем к мРНК. Таким образом, РНК-

связывающие свойства белка TthL1 и его домена I сходны.

Для того чтобы убедиться в регуляторных свойствах домена I белка L1 in

vitro, мы использовали сопряжённую систему транскрипции-трансляции E. coli

38

в присутствии меченого [35S] метионина и плазмиды, несущей ген архейного р-

белка L1 M.vannielii (MvaL1). Участок мРНК рода Methanococcus, с которым

связывается белок L1, располагается в открытой рамке считывания белка

примерно в 30 нуклеотидах от инициаторного кодона. Таким образом, по

интенсивности пятна полноразмерного белка MvaL1 в геле мы определяли

способность

белка

L1

или

его

домена

I

регулировать

трансляцию

соответствующей мРНК. Реакционную смесь мы инкубировали с различными

количествами TthL1 (рис. 27а, дорожки 1-3) и TthL1dI (рис. 27б, дорожки 1-3).

Показано, что, как и полноразмерный белок, его домен I ингибирует синтез

MvaL1 доз-зависимым образом, что свидетельствует о способности TthL1dI

выполнять функции белка-регулятора.

Поскольку сродство TthL1 и TthL1d1 к мРНК слабее, чем к рРНК, в

качестве контроля специфичности может использоваться конкуренция между

рибосомной и матричной РНК за связывание с белком-регулятором.

Добавление в инкубационную смесь L1-специфического фрагмента 23S рРНК

(рРНКL1) снимает ингибирование синтеза MvaL1 белком TthL1 и его доменом I

(рис. 27, дорожки 4 и 5). В свою очередь, добавление в инкубационную смесь

неспецифического фрагмента рРНКL4 (связывающегося с р-белком L4) не

влияет на ингибирование синтеза MvaL1 белками TthL1 и TthL1d1 (рис. 27,

дорожка 6).

Рис. 27. Авторадиограммы белка MvaL1, синтезированного в присутствии

L­[35S]метионина и избытка TthL1 (а) или TthL1d1 (б), а также фрагментов 23S

рРНК, специфически связывающихся с белком TthL1 (рРНКL1) или белком

TthL4 (рРНКL4).

1 - белок не добавлен, 2 - 50 пмоль белка, 3 - 100 пмоль белка,

4 - 100 пмоль белка + 100 пмоль рРНКL1; 5 - 100 пмоль белка + 200 пмоль

рРНКL1, 6 - 100 пмоль белка + 100 пмоль рРНКL4.

39

Учитывая высокую консервативность как р-белка L1, так и L1-

специфического участка на мРНК, можно с высокой степенью вероятности

предположить, что и в других организмах для регуляции трансляции мРНК

белка L1 достаточно лишь домена I этого белка. Видимо, основная роль домена

II сводится к его взаимодействию с тРНК в E-участке рибосомы.

Для выяснения роли доменов рибосомного белка L1 в функционировании

рибосомы, мы создали штамм E. coli (∆L1 штамм), в геноме которого ген rplA,

кодирующий р-белок L1 (EcoL1), заменен на ген устойчивости к канамицину.

Рибосомный белок L1 несущественен для выживания клеток E. coli и Bacillus

subtilus (Akanuma et al., 2012). Полученный нами ∆L1 штамм, так же как

мутанты E. coli, лишённые р-белка L1 (Subramanian & Dabbs, 1980), рос в 2 раза

медленнее родительского штамма. Анализ белкового состава рибосом ∆L1

штамма показал отсутствие данного белка в составе рибосомы (рис. 28б).

На основе вектора pBADET были созданы четыре плазмиды, несущие

гены рибосомных белков TthL1, EcoL1 и их первых доменов (TthL1dI и

EcoL1dI). Белок EcoL1dI (по аналогии с TthL1dI) включает в себя

Рис. 28. Анализ белкового состава рибосом из штамма E. coli дикого типа (а)

и ∆L1 штамма (б). Положение пятна, соответствующего белку EcoL1 указано

стрелкой.

аминокислотные остатки с 1 по 68 и с 159 по 234 белка EcoL1.

Анализ белкового состава 70S рибосом ∆L1 штамма, выращенного в

условиях in trans синтеза любого из этих четырех белков, показал, что все

варианты белка L1 встраиваются в рибосому in vivo и присутствуют в

рибосомах в приблизительно эквимолярных количествах (рис. 29). Таким

образом, мы впервые показали, что изолированный домен I бактериального

40

рибосомного белка L1 способен, так же как целый белок, прочно связываться с

23S рРНК и встраиваться в рибосому in vivo.

Мы предполагаем, что домен II р-белка L1 способствует правильной

ориентации

подвижной

«локтевой»

части

тРНК

на

первых

этапах

взаимодействия L1-тРНК. Так, Рro133 и Arg134 домена II взаимодействуют с

петлёй В 23S рРНК и с D-петлёй деацилированной тРНК. Два аминокислотных

остатка домена I также образуют солевые мостики с нуклеотидами петель

«локтевого» изгиба тРНК в Е-участке, в результате чего деацилированная тРНК

удаляется с рибосомы. Дальнейшие исследования позволят оценить роль

доменов рибосомного белка L1 в функционировании рибосомы и жизни

бактериальной клетки.

Рис. 29. Анализ белкового состава рибосом ∆L1 штамма при синтезе in trans

белков EcoL1 (а), EcoL1d1 (б), TthL1 (в) и TthL1d1 (г). Положение пятен

соответствующих белков указано стрелками.

41

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, полученные в диссертационной работе, позволили уточнить

структуру рибосомы и детально исследовать РНК-белковые взаимодействия в

комплексах, образованных рибосомными белками S8 и L1. Впервые структура

L1-выступа была вписана в модель структуры

большой рибосомной

субчастицы. Сравнительный анализ структур комплексов р-белка L1 cо

специфическими фрагментами рРНК и мРНК выявил структурные элементы

РНК и белка, ответственные за регуляторные свойства белка L1. Показана

определяющая роль домена I белка L1 в функционировании белка как

составной части рибосомы и как регулятора трансляции своей мРНК. Получены

данные, которые впервые показали, что общее количество РНК-белковых

контактов и водородных связей не может считаться единственной мерой

сродства белка TthL1 к РНК. Большинство полученных в работе данных имеют

приоритетный характер и вносят значительный вклад в исследование

структурной

организации

рибосомы,

РНК-белковых

взаимодействий

и

структурных основ регуляции экспрессии генов.

ВЫВОДЫ

1. Взаимодействие двухдоменных рибосомных белков S8 и

L1 со

специфическими фрагментами рРНК осуществляется двумя участками,

расположенными

на

разных

доменах

белков.

Консервативные

аминокислотные остатки

белков образуют сетку внутримолекулярных

водородных связей и формируют поверхности, которые комплементарны

поверхностям на специфических участках

РНК. Основу структурно-

модулей

в

РНК-белковых

комплексах

составляют

недоступные

для

растворителя

межмолекулярные

консервативных

консервативные

водородные связи.

2. Структура комплекса SacL1-рРНК впервые дала возможность вписать L1-

выступ в модель 50S рибосомной субчастицы.

3. Определённая с высоким разрешением структура комплекса TthL1-рРНК

позволила выявить стабильную структуру, образуемую доменом I белка и

Н77 23S рРНК.

4. Определены структурные элементы на белке TthL1 и на рибосомной и

матричной РНК, ответственные за регуляторные свойства белка.

42

5. Показано, что формирование комплексов РНК с мутантными белками L1,

имеющими изменённую поверхность взаимодействия, проходит через

длительную аккомодацию поверхности белка к РНК, включающую

образование промежуточных комплексов и их распад; общее количество

РНК-белковых контактов и водородных связей не является единственной

мерой сродства белка к РНК.

6. Показано, что изолированный домен I TthL1 (TthL1dI) взаимодействует с

РНК так же как в составе целого белка, и поэтому может быть использован

для исследования роли домена I в функционировании белка L1.

7. Кинетические исследования показали, что домен I белка L1 необходим и

достаточен для взаимодействия белка L1 с РНК, причём, его сродство к

рРНК выше, чем к мРНК.

8. Показано, что в системе транскрипции-трансляции in vitro TthL1dI

способен регулировать экспрессию генов архейного L1 оперона так же, как

целый белок L1. Кроме того, TthL1dI и домен I белка L1 E. сoli могут

встраиваться in vivo в рибосомы E. сoli, лишенные белка L1.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.

Tishchenko S.V. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of

ribosomal protein S8 from Thermus thermophilus. / S.V. Tishchenko, V.S.

Vysotskaya, N.P. Fomenkova, S.V. Nikonov, B. Ehresmann, M.B. Garber //

Proteins. – 1997. – Vol. 27. – № 2. – P. 309-310.

2.

Nevskaya N. Crystal structure of ribosomal protein S8 from Thermus

thermophilus reveals a high degree of structural conservation of a specific RNA

binding site. / N. Nevskaya, S. Tishchenko, A. Nikulin, S. Al-Karadaghi, A.

Liljas, B. Ehresmann, C. Ehresmann, M. Garber, S. Nikonov // Journal of

Molecular Biology. – 1998. – Vol. 279. – № 1. – P. 233-244.

3.

Tishchenko S. Crystals of ribosomal protein L1 from a hyperthermophilic

archaeon Methanococcus jannaschii. / S. Tishchenko, S. Nikonov, M. Garber,

A. Kraft, C. Köhrer, W. Piendl // Biochemistry and molecular biology

international. – 1998. – Vol. 45. – № 2. – P. 349-54.

4.

Al-Karadaghi S. Ribosomal proteins and their structural transitions on and off

the ribosome. / S. Al-Karadaghi, N. Davydova, I. Eliseikina, A. Liljas, M.

Garber, N. Nevskaya, S. Nikonov, S. Tishchenko // The Ribosome: Structure,

Function, Antibiotics and Cellular Interaction. / eds. R.A. Garrett [et al.]. –

Washington, DC: ASM Press, 2000. – P. 65-72.

43

5.

Ennifar E. The crystal structure of UUCG tetraloop. / E. Ennifar, A. Nikulin, S.

Tishchenko, A. Serganov, N. Nevskaya, M. Garber, B. Ehresmann, C.

Ehresmann, S. Nikonov, P. Dumas // Journal of Molecular Biology. – 2000. –

Vol. 304. – № 1. – P. 35-42.

6.

Nevskaya N. Archaeal ribosomal protein L1: The structure provides new

insights into RNA binding of the L1 protein family. / N. Nevskaya, S.

Tishchenko, R. Fedorov, S. Al-Karadaghi, A. Liljas, A. Kraft, W. Piendl, M.

Garber, S. Nikonov // Structure. – 2000. – Vol. 8. – № 4. – P. 363-371.

7.

Тищенко С.В. Получение, кристаллизация и исследование комплексов

рибосомного белка S8 со специфическими фрагментами рРНК архейного и

бактериального происхождения. / С.В. Тищенко, Ю.М. Васильева, О.Б.

Платонова, А.А. Серганов, Н.П. Фоменкова, Е.С. Мудрик, В. Пиндл, Ш.

Эресманн, Б. Эресманн, М.Б. Гарбер // Биохимия. – 2001. – Т. 66. – № 9. –

С. 1165-1171.

8.

Tishchenko S. Detailed analysis of RNA-protein interactions within the

ribosomal protein S8-rRNA complex from the archaeon Methanococcus

jannaschii. / S. Tishchenko, A. Nikulin, N. Fomenkova, N. Nevskaya, O.

Nikonov, P. Dumas, H. Moine, B. Ehresmann, C. Ehresmann, W. Piendl, V.

Lamzin, M. Garber, S. Nikonov // Journal of Molecular Biology. – 2001. –

Vol. 311. – № 2. – P. 311-324.

9.

Garber M. Crystallization of RNA / protein complexes. / M. Garber, G.

Gongadze, V. Mesheryakov, O. Nikonov, A. Nikulin, A. Perederina, W. Piendl,

A. Serganov, S. Tishchenko // Acta Crystallographica Section D: Biological

Crystallography. – 2002. – Vol. D58. – P. 1664-1669.

10. Nevskaya N. Structure of ribosomal protein L1 from Methanococcus

thermolithotrophicus. Functionally important structural invariants on the L1

surface. / N. Nevskaya, S. Tishchenko, M. Paveliev, Y. Smolinskaya, R.

Fedorov, W. Piendl, Y. Nakamura, T. Toyoda, M. Garber, S. Nikonov // Acta

Crystallographica Section D: Biological Crystallography. – 2002. – Vol. D58. –

P. 1023-1029.

11. Nikulin A. Structure of the L1 protuberance in the ribosome. / A. Nikulin, I.

Eliseikina, S. Tishchenko, N. Nevskaya, N. Davydova, O. Platonova, W.

Piendl, M. Selmer, A. Liljas, D. Drygin, R. Zimmermann, M. Garber, S.

Nikonov // Nature structural biology. – 2003. – Vol. 10. – № 2. – P. 104-108.

12. Nevskaya N. Ribosomal protein L1 recognizes the same specific structural motif

in its target sites on the autoregulatory mRNA and 23S rRNA. / N. Nevskaya, S.

Tishchenko, A. Gabdoulkhakov, E. Nikonova, O. Nikonov, A. Nikulin, O.

Platonova, M. Garber, S. Nikonov, W. Piendl // Nucleic Acids Research. –

2005. – Vol. 33. – № 2. – P. 478-485.

13. Тищенко С.В. Взаимодействие рибосомного белка L1 c рибосомной и

матричной РНК. / С.В. Тищенко, E.Ю. Никонова, Н.А. Невская, О.С.

Никонов, М.Б. Гарбер, С.В. Никонов // Молекулярная биология. – 2006. –

Т. 40. – № 4. – С. 650-657.

44

14. Nevskaya N. New insights into the interaction of ribosomal protein L1 with

RNA. / N. Nevskaya, S. Tishchenko, S. Volchkov, V. Kljashtorny, E.

Nikonova, O. Nikonov, A. Nikulin, C. Köhrer, W. Piendl, R. Zimmermann, P.

Stockley, M. Garber, S. Nikonov // Journal of Molecular Biology. – 2006. –

Vol. 355. – № 4. – P. 747-759.

15. Tishchenko S. Structure of the ribosomal protein L1-mRNA complex at 2.1 Å

resolution: common features of crystal packing of L1-RNA complexes. / S.

Tishchenko, E. Nikonova, A. Nikulin, N. Nevskaya, S. Volchkov, W. Piendl,

M. Garber, S. Nikonov // Acta Crystallographica Section D: Biological

Crystallography. – 2006. – Vol. D62. – № Pt 12. – P. 1545-1554.

16. Никонова Е.Ю. Кристаллические структуры мутантных форм рибосомного

белка L1. / Е.Ю. Никонова, С.А. Волчков, В.Г. Кляшторный, С.В.

Тищенко, О.С. Костарева, Н.А. Невская, О.С. Никонов, А.Г. Габдулхаков,

А.Д. Никулин, Н.Л. Давыдова, В.А. Стрельцов, М.Б. Гарбер, С.В. Никонов

// Молекулярная биология. – 2007. – Т. 41. – № 4. – С. 688-696.

17. Tishchenko S. Domain I of ribosomal protein L1 is sufficient for specific RNA

binding. / S. Tishchenko, E. Nikonova, V. Kljashtorny, O. Kostareva, N.

Nevskaya, W. Piendl, N. Davydova, V. Streltsov, M. Garber, S. Nikonov //

Nucleic Acids Research. – 2007. – Vol. 35. – № 21. – P. 7389-7395.

18. Tishchenko S. Domain II of Thermus thermophilus ribosomal protein L1

hinders recognition of its mRNA. / S. Tishchenko, V. Kljashtorny, O.

Kostareva, N. Nevskaya, A. Nikulin, P. Gulak, W. Piendl, M. Garber, S.

Nikonov // Journal of Molecular Biology. – 2008. – Vol. 383. – № 2. – P. 301-

305.

19. Никонова Е.Ю. Кристаллическая структура рибосомного белка L1 из

бактерии Aquifex aeolicus. / Е.Ю. Никонова, С.В. Тищенко, А.Г.

Габдулхаков, А.А. Шкляева, М.Б. Гарбер, С.В. Никонов, Н.А. Невская //

Кристаллография. – 2011. – Т. 56. – № 4. – С. 648-652.

20. Kostareva O. Disruption of shape complementarity in the ribosomal protein L1-

RNA contact region does not hinder specific recognition of the RNA target site.

/ O. Kostareva, S. Tishchenko, E. Nikonova, V. Kljashtorny, N. Nevskaya, A.

Nikulin, A. Sycheva, S. Moshkovskii, W. Piendl, M. Garber, S. Nikonov //

Journal of Molecular Recognition. – 2011. – Vol. 24. – № 4. – P. 524-532.

21. Tishchenko S. Structural analysis of interdomain mobility in ribosomal L1

proteins. / S. Tishchenko, E. Nikonova, O. Kostareva, A. Gabdulkhakov, W.

Piendl, N. Nevskaya, M. Garber, S. Nikonov // Acta Crystallographica Section

D: Biological Crystallography. – 2011. – Vol. 67. – № 12. – P. 1023-1027.

22. Tishchenko S. High-resolution crystal structure of the isolated ribosomal L1

stalk. / S. Tishchenko, A. Gabdulkhakov, N. Nevskaya, A. Sarskikh, O.

Kostareva, E. Nikonova, A. Sycheva, S. Moshkovskii, M. Garber, S. Nikonov //

Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. – 2012. –

Vol. 68. – № 8. – P. 1051-1057.

45

23. Сарских А.В.

Влияние

электростатических

взаимодействий

на

формирование и стабильность комплексов рибосомного белка L1 с РНК. /

А.В. Сарских, О.С. Костарева, В.А. Балобанов, С.В. Тищенко // Вестник

Удмуртского университета. – 2013. – Т. 6. – № 4. – С. 90-95.

24. Сарских А.В. Кристаллическая структура мутантной формы рибосомного

белка L1 из археи Methanococcus jannashii. / А.В. Сарских, А.Г.

Габдулхаков,

О.С.

Костарева,

А.А.

Шкляева,

С.В.

Тищенко

//

Кристаллография. – 2014. – Т. 59. – № 3. – С. 438-442.

25. Korepanov A.P. Studying the properties of domain I of the ribosomal protein

L1: incorporation into ribosome and regulation of the L1 operon expression. /

A.P. Korepanov, O.S. Kostareva, M.V. Bazhenova, M.G. Bubunenko, M.B.

Garber, S.V. Tishchenko // The Protein Journal. – 2015. – Vol. 34. – № 2. –

P. 103-110.

26. Tishchenko S. Protein–RNA affinity of ribosomal protein L1 mutants does not

correlate with the number of intermolecular interactions. / S. Tishchenko, O.

Kostareva, A. Gabdulkhakov, A. Mikhaylina, E. Nikonova, N. Nevskaya, A.

Sarskikh, W. Piendl, M. Garber, S. Nikonov // Acta Crystallographica Section

D: Biological Crystallography. – 2015. – Vol. 71. – № 2. – P. 376-386.

46



Похожие работы:

«КУЗЬМИНА УЛЬЯНА ШАФКАТОВНА РЕГУЛЯЦИЯ NMDA-РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2015 Доктор биологических наук Доктор медицинских наук Доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО Башкирский государственный университет, г. Уфа Доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник ФГБНУ Научный центр неврологии,...»

«КОЧКОНЯН Анжела Суреновна ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ У ДЕТЕЙ СО СЪЁМНОЙ ОРТОДОНТИЧЕСКОЙ АППАРАТУРОЙ 03.01.04 – биохимия 14.01.14 – стоматология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Краснодар – 2015 Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации...»

«Бучельников Анатолий Сергеевич Развитие теории интерцепторно-протекторного действия при совместном связывании биологически активных соединений с ДНК 03.01.02 Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Пущино 2015 Работа выполнена на кафедре Физика ФГАОУ ВО Севастопольский государственный университет Научный руководитель: Евстигнеев Максим Павлович, доктор физико-математических наук, профессор Официальные оппоненты:...»





 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.