авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

На правах рукописи

Котова

Полина Дмитриевна

ПУРИНЕРГИЧЕСКАЯ И АДРЕНЕРГИЧЕСКАЯ

СИГНАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ

МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК

03.01.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пущино – 2015

Работа

выполнена

в

лаборатории

молекулярной

физиологии

клетки

Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института

биофизики клетки Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Колесников Станислав Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Орлов Николай Яковлевич

(зав. лаб. функциональной биофизики белка

Института теоретической и экспериментальной

биофизики РАН, г. Пущино),

кандидат биологических наук

Калинина Наталья Игоревна

(доцент кафедры биохимии и молекулярной

медицины

факультета

фундаментальной

медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва)

Ведущая организация:

Федеральное

государственное

бюджетное

учреждение науки Институт биологии развития

им. Н.К. Кольцова Российской академии наук,

г. Москва

Защита состоится «__» _______ 201_ г. в __ час. __ мин. на заседании Совета

Д002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата

наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном

государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и

экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290,

Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по

адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, и на сайте

ИТЭБ РАН: http://web.iteb.psn.ru

Автореферат диссертации разослан «__» _______ 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

к.ф.-м.н.

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Мезенхимные

стромальные

клетки

(МСК)

представляют

собой

недифференцированные

мультипотентные

клетки,

популяция

которых

поддерживается

за

счет

пролиферации,

и

которые

способны

дифференцироваться в клетки как минимум костной, хрящевой и жировой

тканей (Caplan, 2007; Dominici et al., 2009; Kalinina et al., 2011). МСК могут

быть выделены из многих тканей взрослого организма, однако основными их

источниками служат костный мозг и жировая ткань.

МСК обладают высоким терапевтическим потенциалом, и исследование

различных

аспектов

их

жизнедеятельности

представляет

несомненный

академический и практический интерес. Большинство работ по исследованию

МСК посвящены оценке их трансплантационного потенциала, исследованию

механизмов, инициирующих и направляющих их дифференцировку, или

анализу возможности управлять этими процессами in vitro. Гораздо меньшее

внимание уделяется фундаментальным исследованиям сигнальных процессов в

этих клетках. В силу этого существующие представления о рецепторных и

сигнальных системах МСК весьма ограничены. Между тем естественно

полагать, что межклеточные и внутриклеточные коммуникации, паракринные и

аутокринные регуляции, вовлекающие различные сигнальные молекулы и

рецепторные системы, должны играть ключевую роль в физиологических

процессах, детерминирующих жизнедеятельность МСК. Исследования Ca2+

сигнализации в МСК представлены единичными работами и касаются изучения

спонтанных кальциевых осцилляций и участия внешнего кальция в развитии

МСК (Ye, 2010). Тогда как более актуальным представляется изучение

индуцированной Ca2+ сигнализации, в том числе, агонистами различных

рецепторов, т.к. среди них могут оказаться агенты, контролирующие

пролиферацию МСК и запускающие их дифференцировку (Doze, Perez, 2012),

что представляет несомненный практический интерес. В данной работе

исследовалась

Ca2+

сигнализация,

инициируемая

пуринергическими

и

адренергическими агонистами в цитоплазме МСК, выделенных из жировой

ткани человека.

Пуринергическая сигнальная система была выбрана нами в связи с тем,

что повреждение тканей ассоциируется с выбросом большого количества ATP

во внеклеточную среду, который может стимулировать МСК, мигрирующие в

зону повреждения. Поэтому можно ожидать, что пуринергическая сигнальная

система является естественной частью системы регуляции клеточных функций

МСК. Адренергическая система привлекла наше внимание, поскольку

1

продемонстрировано,

что

МСК

костного

мозга

пространственно

ассоциированы с адренергическими нервными волокнами (Mendez-Ferrer et al,

2010), а физиологические процессы во многих периферических тканях, в клетки

которых могут дифференцироваться МСК, модулируются адреналином и

норадреналином. Немаловажным обстоятельством было также то, что

пуринергические и адренергические агонисты стимулируют Ca2+ сигнализацию

(Scanzano, Cosentino, 2015), и поэтому их трансдукцию можно анализировать с

использованием эффективного метода микрофотометрии (Ca2+-imaging).

Цели и задачи исследования

Целью

данной

работы

было

изучение

пуринергической

и

адренергической сигнальных систем МСК в части, касающейся идентификации

типов пурино- и адренорецепторов, функционирующих в МСК, а также анализа

механизмов сопряжения этих рецепторов с мобилизацией внутриклеточного

Са2+.

В рамках сформулированной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать

пуринергическую

сигнальную

систему

МСК.

Выяснить, какие типы пуринорецепторов обеспечивают чувствительность

МСК к экстраклеточным нуклеотидам, и исследовать механизм сопряжения

этих рецепторов с клеточными ответами.

2. Исследовать

адренергическую

сигнальную

систему

МСК.

Выяснить, какие типы адренорецепторов функционируют в МСК, и

проанализировать механизмы, обеспечивающие генерацию Са2+ ответов при

стимуляции МСК адренергическими агонистами.

Научная новизна

В

настоящей

работе

проведены

пионерские

исследования

пуринергической и адренергической сигнальных систем на уровне одиночных

МСК, выделенных из жировой ткани человека. Впервые показано, что Са2+

ответы на адренергические и пуринергические агонисты генерируются МСК по

принципу

«все

или

ничего».

Этот

феномен

объясняется

тем,

что

адренергическая и пуринергическая трансдукции протекают в две стадии. На

первом этапе происходит генерация Са2+ сигнала агонист-зависимым образом,

который затем усиливается по механизму Са2+-индуцированного Са2+ выброса

до максимальной амплитуды, где роль Са2+ триггера выполняют IP3 рецепторы.

Впервые показано, что P2Y1, P2Y2 и P2Y4 являются основными типами

пуринорецепторов МСК, вовлеченными в мониторинг экстраклеточных

нуклеотидов. Установлено, что среди α1B-, α2A-, и β2-адренорецепторов,

экспрессирующихся

в

МСК,

преимущественно

α2A-адренорецептор

ответственен за генерацию Са2+ ответов клеток на норадреналин.

2

Научно-практическая значимость работы

Проведенные исследования значительно расширяют существующие

представления о рецепторных и сигнальных системах МСК и детализируют

механизмы

внутриклеточной

Са2+

сигнализации,

инициируемой

пуринергическими и адренергическими агонистами в цитоплазме этих клеток.

Учитывая высокий терапевтический потенциал МСК, полученные в работе

результаты могут быть использованы для отбора и/или потенциации МСК для

целей регенеративной медицины.

Апробация работы

Основные

результаты

диссертации

были

представлены

на

международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология –

наука XXI века» (Пущино, 2012, 2013, 2014, 2015), на международной

конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2013,

2015), на IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), на V

всероссийской научно-практической конференции «Стволовые клетки и

регенеративная медицина» (Москва, 2013), на IV съезде физиологов СНГ (Сочи

– Дагомыс, 2014).

Структура и объем диссертации

Диссертационная

работа

содержит

введение,

обзор

литературы,

материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение,

выводы и список литературы. Работа изложена на 91 страницах, содержит 28

рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 234 источников

отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Исследования проводили на первичной культуре

МСК, выделенных из жировой ткани человека. Жировую ткань забирали из

подкожной жировой клетчатки здоровых доноров при проведении плановых

операций (возраст доноров от 31 до 50 лет).

Первичное выделение МСК из жировой ткани проводили сотрудники

кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной

медицины МГУ им. М.В. Ломоносова по стандартной методике (Zuk et al.,

2001).

Подготовка клеток к эксперименту

МСК культивировали в среде роста: Advance Stem (HyClone) с 10%

Advance Stem Supplement (HyClone), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл

стрептомицина. За сутки перед экспериментом ростовую среду заменяли на

такую же без антибиотика. Непосредственно перед экспериментом клетки

снимали

с

культурального

пластика,

осаждали

центрифугированием,

3

прикрепляли с помощью Cell Tak (BD Biosciences) на дно фотометрической

камеры.

Для

загрузки

флуоресцентным

Са2+-зондом

Fluo-4

клетки

инкубировали

при

комнатной

температуре

(23–25 °С)

в

присутствии

проникающего аналога Fluo-4 AM (4 мкМ) и детергента Pluronic (0.02%) (оба

Molecular

Probes)

в

течение

20

мин,

что

обеспечивало

гидролиз

внутриклеточными

эстеразами

ацетоксиметиловой

группы

Fluo-4AM,

достаточный для достижения необходимого уровня Fluo-4 в клетках. Затем

клетки при 4 °С в течение 40 мин отмывали внеклеточным раствором,

содержащим (мМ): 110 NaCl, 5.5 KCl, 2 CaCl2, 0.8 MgSO4, 10 HEPES, 10

глюкозы (все Sigma-Aldrich). В экспериментах, где требовалось снизить

содержание свободного Са2+ во внешнем растворе с 2 мМ до 260 нМ, 2 мМ

CaCl2 заменяли на 0.5 мМ EGTA + 0.4 мМ CaCl2.

Микрофотометрия (Ca2+-imaging). Эксперименты по микрофотометрии

проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа

Axiovert 135 (Zeiss), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20x/0.75 и

цифровой ECCD камерой LucaR (Andor Technology). Помимо осветителя

проходящего света микроскоп был оборудован оптоволоконным осветителем

для освещения через объектив. Один из входов бифуркационного оптического

волокна соединяли с осветителем на сверхъярких диодах (340–535 нм) (Хохлов

А.А., 2007) для возбуждения флуоресценции, а другой – с лазером LCS-DTL-

374QT (Лазер-Экспорт) ультрафиолетового (UV) диапазона (355 нм) для

фотолиза.

МСК

нагружали

флуоресцентным

Ca2+-зондом

Fluo-4,

флуоресценцию которого возбуждали на длине волны 480 ± 5 нм, а эмиссию

регистрировали в области 535 ± 20 нм. Каждые 0.5 секунды регистрировали

последовательные флуоресцентные изображения. Изменение концентрации

цитозольного

кальция

в

индивидуальных

клетках

оценивали

по

относительному изменению интенсивности флуоресценции целой клетки

(ΔF/F0). Количественный фотометрический анализ изображений осуществляли

с использованием программы Imaging Workbench 6 (INDEC).

Фотолиз химических групп (uncaging). В работе использовали Ca2+-

uncaging, который позволяет производить скачкообразное и контролируемое

повышение

концентрации

цитозольного

Ca2+.

Клетки

инкубировали

в

присутствии NP-EGTA AM (Molecular Probes). Этот предшественник проникает

в клетки, где путем гидролиза конвертируется в фоточувствительный Ca2+-

хелатор NP-EGTA. Последний связывает свободный Ca2+ внутри клетки и

может

высвобождать

его

после

деструкции

импульсом

света

ультрафиолетового

(UV)

диапазона.

Одновременная

загрузка

клеток

флуоресцентным Ca2+-зондом Fluo-4 и NP-EGTA позволяла оценивать

изменение концентрации цитозольного Ca2+ за счет Fluo-4 и скачкообразно

повышать ее в нужный момент за счет фотолиза NP-EGTA.

4

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. Функциональная гетерогенность популяции МСК

Исследование чувствительности одиночных МСК к различным агонистам

гептаспиральных (G-protein-coupled, GPCR) рецепторов позволило установить,

что популяция МСК проявляет признаки гетерогенности. Большая часть клеток

(50%) не генерировала Ca2+ ответы ни на один из стимулов, причем 2 – 5%

этих МСК генерировали спонтанные Са2+ осцилляции (Рис. 1F). Остальные же

клетки оказались способны генерировать Ca2+ ответы на широкой спектр

агонистов. Обычно индивидуальные клетки специфически отвечали только на

определенный

агонист

(АТР,

аденозин,

норадреналин

или

адреналин,

серотонин, ГАМК, карбахол, глутамат) (Рис. 1 A-E), реже на два или большее

количество агонистов. Кратковременные аппликации (~100 с) агониста

вызывали в чувствительных к нему клетках типичное кратковременное

повышение концентрации внутриклеточного Ca2+.

Рис.

1.

Функциональная

гетерогенность популяции МСК.

А-E – Специфические ответы на

различные

агонисты

гептаспиральных рецепторов.

Агонисты

апплицировали

в

следующих концентрациях:

Норадреналин (Nor) – 0.5 мкМ,

АТФ (ATP) – 10 мкМ,

Серотонин (Ser) – 10 мкМ,

ГАМК (GABA) – 20 мкМ,

Карбахол (Carb) – 20 мкМ.

F - Ca2+ активность клетки,

генерирующей

спонтанные

Ca2+-

осцилляции.

Здесь

и

далее

на

рисунках

представлены

репрезентативные

регистрации

Ca2+

ответов

одиночных

МСК,

начало

и

длительность

стимуляций

обозначены

горизонтальными

линиями выше экспериментальной

кривой.

5

Всего было последовательно простимулировано различными агонистами

958 МСК, 302 из которых (31%) специфически отвечали на некоторые из них.

Из этих агонист-чувствительных МСК АТР-чувствительные клетки составляли

наибольшую субпопуляцию – 112 (37%) клеток, субпопуляции клеток,

чувствительных

к

ГАМК,

норадреналину

и

серотонину

составляли

приблизительно

15%

каждая,

чувствительных

к

карбахолу

(агонист

холинергических рецепторов) МСК насчитывалось 10,6%, в то время как

аденозин-

и

глутамат-чувствительные

субпопуляции

были

самыми

малочисленными и составляли 2,6% и 3,6% клеток соответственно.

Таким образом, популяция МСК человека, выделенных из жировой

ткани, функционально гетерогенна и включает малочисленные субпопуляции

клеток, которые специфически чувствительны к определенному лиганду из

исследовавшегося набора агонистов GPCR рецепторов.

II. Адренергическая сигнальная система МСК

На следующем этапе работы исследовались механизмы генерации Ca2+

сигналов,

инициируемых

норадреналином

в

цитоплазме

МСК.

Адренергическая система была выбрана нами поскольку продемонстрировано,

что МСК костного мозга пространственно ассоциированы с адренергическими

нервными волокнами, а физиологические процессы во многих тканях

модулируются

адреналином

и

норадреналином.

Хотя

в

описываемых

экспериментах МСК отвечали на оба природных агониста адренорецепторов,

нами использовался преимущественно норадреналин (n500), поскольку он

более эффективен по отношению к a-адренорецепторам, которые сопряжены с

Ca2+ сигнализацией в самых разнообразных клетках.

II.1. Роль Са2+ входа и выброса депонированного Са2+ в генерации

ответов МСК на норадреналин

На первом этапе изучения ответов МСК на норадреналин оценивался

вклад в генерацию Ca2+ сигналов входа внешнего Ca2+ и его выброса из

внутриклеточных депо. В общей сложности было проанализировано 317 МСК,

чувствительных к норадреналину. Оказалось, что кинетика и амплитуда Ca2+

ответов практически не менялись при снижении наружного Ca2+ с 2 мМ до

примерно цитоплазматического уровня (260 нм) (Рис. 2А).

Предварительная инкубация МСК (200 – 300 с) в присутствии ингибитора

фосфолипазы C (U73122) приводила к полному подавлению Ca2+ ответов на

норадреналин. Действие U73122 можно считать специфичным, т.к. его

неактивный аналог U73343 не влиял на способность МСК отвечать на

норадреналин (Рис. 2B) (n=17).

6

В различных клетках стимул-зависимое высвобождение депонированного

Ca2+ происходит при участии рианодиновых и/или IP3 рецепторов, являющихся

лиганд-активируемыми

Ca2+

каналами

эндоплазматического

ретикулума

(Clapham D.E. 2007). Предварительная инкубация МСК с антагонистом IP3

рецепторов (2-APB) приводила к обратимому подавлению ответов на

норадреналин, тогда как ингибитор рианодиновых рецепторов (Ryanodine) не

влиял на чувствительность МСК к норадреналину (Рис. 2C) (n=12).

Рис. 2. Вклад фосфоинозитидного сигнального каскада в ответы МСК на норадреналин.

А – Ответ на норадреналин в условиях пониженной концентрации Ca2+ в наружной среде.

Верхняя линия иллюстрирует изменение концентрации внеклеточного Ca2+.

B – Ответы МСК на норадреналин не подавляются неактивным аналогом ингибитора

фосфолипазы C (U73343), но полностью и необратимо подавляются ингибитором

фосфолипазы С (U73122).

C – Антагонист IP3 рецепторов (2-APB) полностью подавляет способность клеток

генерировать ответы на норадреналин, тогда как ингибитор рианодиновых рецепторов

(ryanodine) на нее не влияет.

Таким образом, данные ингибиторного анализа (Рис. 2) свидетельствуют

о том, что генерация Ca2+ ответов на норадреналин в МСК происходит за счет

высвобождения Ca2+ из внутриклеточных депо, опосредованного работой

фосфолипазы C и активацией IP3 рецепторов. Иными словами, адренергическая

трансдукция в МСК протекает при участии классического фосфоинозитидного

пути.

7

в то время как при

максимальный

или

экспериментов.

более высоких концентрациях норадреналин вызывал

почти

максимальный

Ca2+

ответ

в

большинстве

Порогом для генерации ответа оказалась концентрация норадреналина

100 – 200 нМ (n=29). Мы разделили адренергические МСК на 2 группы,

основываясь на демонстрируемых ими кривых доза – ответ. Большая из них

(n=21) состояла из клеток, которые генерировали максимальные Ca2+ ответы на

норадреналин независимо от его концентрации (Рис. 3C). Другая группа,

состоящая из 8 клеток, имела несколько иную дозозависимость (Рис. 3D). 5

клеток демонстрировали большие (65 – 75%), но не максимальные ответы на

пороговую концентрацию норадреналина, амплитуда Ca2+ ответов этих клеток

росла

с

увеличением

концентрации

агониста.

Оставшиеся

3

клетки

продемонстрировали максимальный ответ на пороговую концентрацию

агониста, однако, в дальнейшем демонстрировали различные по амплитуде

ответы при росте концентрации агониста (Рис. 3D). Однако ни одна

адренергическая МСК не демонстрировала Ca2+ ответы на пороговую

концентрацию норадреналина амплитудой меньше 65% от максимальной.

Еще одной характерной чертой ответов на норадреналин было то, что они

были заметно отсрочены от момента аппликации агониста, и длительность

задержки ответа падала с повышением концентрации агониста (Рис. 3E,F). Так,

например, задержка Ca2+ ответов на пороговую концентрацию норадреналина у

клетки, представленной на рисунке 3E, составляла 55 с, тогда как при

стимуляции ее норадреналином в концентрации 0.5 мкМ задержка падала до

17 с, амплитуда же ответов при этом оставалась постоянной.

8

II.2.

Зависимость

ответов

МСК

на

норадреналин

от

его

концентрации

Для Ca2+ ответов МСК на норадреналин была характерна интересная

особенность: амплитуда генерируемых Ca2+ ответов фактически не зависела от

концентрации норадреналина (Рис. 3 A,B). Иначе говоря, норадреналин

никогда не вызывал детектируемых ответов, при концентрациях ниже 100 нМ,

Рис. 3. Зависимость ответов МСК на норадреналин от его концентрации

A – Ответы МСК на норадреналин в широком диапазоне концентраций с большим

шагом,

B – Ответы МСК на норадреналин в узком диапазоне концентраций с малым шагом.

C, D – Дозозависимость ответов МСК на норадреналин. Каждый символ соответствует

одной клетке. Серой полосой выделены концентрации норадреналина, являющиеся

пороговыми (100 – 200 нМ). Объяснения в тексте.

E – Ответы на норадреналин в концентрациях 100 нМ и 500 нМ. Приведенные ответы

имели задержку от момента аппликации норадреналина 55 и 17 с соответственно.

Длительность задержки (τd) рассчитывали как время необходимое для достижения ответом

половины своего максимального значения.

F – Зависимость длительности задержки ответа от концентрации норадреналина. На

рисунке представлены средние значения времени задержки ± стандартная ошибка (n=5-8).

9

II.3. Кальций-индуцированный выброс Ca2+ из внутриклеточных

депо как механизм усиления в генерации Ca2+-ответов МСК на

норадреналин

Большинство

клеток,

использующих

фосфоинозитидный

трансдукционный каскад, генерируют ответы, амплитуда которых градуально

зависит от концентрации агониста (Berg et al., 1994; Petrel et al., 2004).

Отмеченные выше особенности ответов на норадреналин - независимость

амплитуды ответов от концентрации норадреналина и зависимость задержки

ответа

от

его

концентрации

трудно

объяснить

только

в

рамках

фосфоинозитидного сигнального пути: рецептор → фосфолипаза С →

генерация IP3 → активация IP3 рецептора → выброс депонированного Са2+.

Поэтому мы предположили, что адренергическая трансдукция в МСК протекает

в две последовательные стадии. На первом этапе норадреналин вызывает

небольшой Ca2+ сигнал, который при достижении некоторого порогового

уровня запускает Ca2+-зависимый триггерный процесс и тем самым усиливается

до

насыщающего

уровня,

независящего

от

концентрации

агониста.

Первоначальный

Са2+

сигнал,

скорее

всего,

градуально

зависит

от

концентрации агониста, иначе трудно понять почему задержка ответа

уменьшается с ростом концентрации норадреналина. Предполагаемый Са2+-

зависимый триггерный механизм описан для самых разнообразных клеток – это

Ca2+-индуцированный выброса Ca2+ из внутриклеточных депо (Ca2+-induced

Ca2+ release, CICR) (Berridge et al., 2003; Clapham, 2010; Iino, 2010).

Идея существования CICR в МСК проверялась нами с использованием

фоточувствительного Ca2+ хелатора NP-EGTA, фотолиз которого импульсом

UV

света

приводит

к

скачкообразному

повышению

концентрация

внутриклеточного Ca2+ (Ca2+-uncaging). Во всех исследованных клетках (n=33)

UV импульс вызывал оптический артефакт, за которым следовал Ca2+ сигнал.

UV импульсы различной длительности вызывали Ca2+ ответы двух типов.

Короткие ( 3 с) импульсы вызывали небольшое подпороговое повышение

внутриклеточного Ca2+ с характерной моноэкспоненциальной релаксацией (Рис.

4А, ответ 1; Рис. 4B, жирная линия (1)). Последующие 4 и 6 секундные

вспышки вызывали двухфазные Ca2+ ответы, амплитуда которых не зависела от

продолжительности вспышки ультрафиолета (Рис. 4А). Никакой из известных

Ca2+-зависимых механизмов не способен так усилить и придать такую форму

первичному Ca2+ сигналу, вызванному фотолизом NP-EGTA, кроме Ca2+-

индуцированного выброса Ca2+ (Рис. 4, ответ 1 по сравнению с ответом 2).

Более того, ответы на норадреналин и ответы на скачкообразное повышение

концентрации внутриклеточного Ca2+ были крайне близки по своей форме и

амплитуде (Рис. 4B символы (3) и тонкая линия (2)).

10

Рис. 4. Ответы МСК, нагруженных Fluo-4 и NP-EGTA.

A – Ответы МСК на вспышки ультрафиолета (UV) разной длительности (2, 4 и 6 с), и

норадреналин. Объяснения в тексте.

B – Наложение ответов одной МСК на вспышки UV различной длительности (1, 2 –

ответы на вспышку UV 2 и 6 с соответственно) и на норадреналин 0.5 мкМ (3).

Таким образом, адренергические МСК обладали характерным свойством

отвечать по принципу “все или ничего” и на стимуляцию норадреналином, и на

скачкообразное повышение концентрации внутриклеточного Ca2+.

Хотя

приведенные

выше

факты

(Рис.4)

подтверждали

идею

существования явления CICR в адренергических МСК, нами рассматривалась

возможность

того,

что

скачкообразное

повышение

концентрации

внутриклеточного

Ca2+

стимулировало

фосфолипазы,

активируемые

непосредственно Ca2+ (Dupont et al., 2007; Park et al., 2012). В этом случае,

фотолиз NP-EGTA мог бы стимулировать продукцию IP3 и высвобождению

Ca2+ из внутриклеточных депо, таким образом, стимулируя норадреналин-

подобный ответ. Между тем, проведенные эксперименты показали, что даже в

присутствии ингибитора фосфолипазы C нагруженные NP-EGTA клетки

генерировали полноценные Ca2+ сигналы в ответ на вспышку ультрафиолета

(n=7) (Рис. 5A). Это свидетельствовало о том, что Ca2+ способен напрямую, т.е.

без участия Ca2+-активируемых фосфолипаз, инициировать масштабный выброс

депонированного Ca2+ по механизму Ca2+-индуцированного выброса Ca2+.

На данный момент известно, что в механизме Ca2+-индуцированного

выброса Ca2+ могут быть задействованы как рианодиновые так и IP3 рецепторы

(Iino, 2010; Dupont et al., 2007; Kawamoto et al., 2012). Оказалось, что ингибитор

рианодиновых рецепторов (Ryanodine) не подавлял ответы на скачкообразное

повышение концентрации внутриклеточного Ca2+, тогда как антагонист IP3

рецепторов (2-APB) напротив их обратимо подавлял (Рис. 5B). Эти данные

свидетельствуют о том, что именно IP3 рецепторы детерминируют Ca2+-

индуцированный выброс Ca2+ в МСК.

11

Рис. 5. Ответы МСК, нагруженных Fluo-4 и NP-EGTA, на норадреналин и UV импульсы.

A – Ответы на норадреналин и вспышку UV в присутствии ингибитора фосфолипазы С

(U73122) и его неактивного аналога (U73343).

B – Ответы на вспышку UV в присутствии антагониста IP3 рецепторов (2-APB) и

ингибитора рианодиновых рецепторв (Ryanodine).

Таким образом, проведенные эксперименты (Рис. 4, 5) не оставляли

сомнения в том, что механизм Ca2+-индуцированного выброса функционирует в

адренергических МСК и вовлекает исключительно IP3 рецепторы, и что

благодаря

этому

регенеративному

процессу,

ответы

на

норадреналин

генерируются в МСК по принципу «все или ничего».

II.4. Типы адренорецепторов, обеспечивающие чувствительность

МСК к норадреналину

Помимо механизмов генерации ответов мы анализировали какие типы

адренорецепторов функционируют в МСК и обеспечивают их чувствительность

к норадреналину. В качестве первого шага был проведен поиск транскриптов

генов

адренорецепторов.

РНК

выделялась

из

суспензии

МСК

и

анализировалась с помощью ОТ-ПЦР. Оказалось, что все образцы РНК (n=12)

содержали транскрипты α1B-, α2A- и β2-адренорецепторов. Экспрессия в МСК α1-

и α2-адренорецепторов также была подтверждена методом иммуногистохимии с

использованием специфических антител, все проанализированные образцы

МСК

(n=7)

содержали

небольшую

(2

-

4%)

субпопуляцию

клеток,

демонстрирующих α1- и α2- иммунореактивность.

12

Для демонстрации функциональности выявленных в МСК подтипов

адренорецепторов был проведен ряд физиологических экспериментов с

использованием специфических агонистов и антагонистов α1-, α2- и β-

адренорецепторов. Все норадреналин-чувствительные клетки генерировали

Ca2+

ответы

на

агонисты

α2-адренорецепторов,

а

антагонист

α2-

адренорецепторов всегда блокировал ответы на норадреналин (n=35) (Рис. 6A-

B). К агонистам же и α1-адренорецепторов были чувствительны всего 17%

клеток (Рис. 6C), а антагонист α1-адренорецепторов никогда не блокировал

ответы на норадреналин (Рис. 6A-B).

Совокупность физиологических и молекулярно-биологических данных

играют доминантную роль в

указывает на то, что α2A-адренорецепторы

генерации МСК Ca2+-ответов на норадреналин.

Рис. 6. Функциональная экспрессия α-адренорецепторов.

Ответы одиночных МСК на агонисты и антагонисты α-адренорецепторов.

Агонисты α1-адренорецепторов – фенилэфрин (Phen), циразолин (Cir); антагонист α1-

адренорецепторов – празосин (Praz); агонисты α2-адренорецепторов – гуанобенц (Guan), B-HT

933 (B-HT); антагонист α2-адренорецепторы – иохимбин (Yoh).

13

Оставалось неясным, играют ли какую-либо роль в генерации МСК Ca2+-

ответов на норадреналин β2-адренорецепторы, обычно несопряженные с Ca2+-

сигнализацией. Роль β2-адренорецепторов исследовали, используя агонист

(Isoproterenol) и антагонист (Alprenolol) β-адренорецепторов. Изопротеренол не

влиял на ответы МСК на норадреналин (n=9) (Рис. 7). Однако действие

альпренолола (антагонист β2-адренорецепторов) было весьма неожиданным: в

его

присутствии

адренергические МСК

обратимо

теряли

способность

генерировать ответы на норадреналин (n=16) (Рис. 7).

Рис. 7. Функциональная экспрессия β-адренорецепторов.

Ответы на норадреналин не изменяются в присутствии агониста β-адренорецепторов (Iso)

и полностью подавляются антагонистом β-адренорецепторов (Alp).

В настоящее время мы не имеем убедительного объяснения этому

феномену, но предполагаем, что он свидетельствует о том, что механизм

генерации МСК Са2+-ответов на норадреналин значительно более сложный, чем

представлялся нам до этого. Например, теоретически ингибирующий эффект

альпренолола может быть объяснен концепцией направленного агонизма

(biased agonism) (Shenoy et al., 2006; Patel et al., 2010; Rajagopal et al., 2010).

Описано, что альпренолол стимулирует сопряжение β1- и β2-адренорецепторов

с ERK1/2 киназой через β-аррестин (Kim et al., 2008; Coffa et al., 2011). Вполне

поэтому возможно, что альпренолол влияет на ответы МСК на норадреналин,

стимулируя

β2-адренорецепторы

как

агонист, способный

инициировать

сигнализацию, связанную с β-аррестином. Этот аррестин-зависимый путь

может пересекаться с механизмом трансдукции адренергического сигнала и

препятствовать ему, делая МСК неспособными генерировать ответы на

норадреналин. На данный момент существование такой сигнализации в МСК не

показано,

и

анализ

рассматриваемой

возможности

представляется

целесообразным.

Таким образом, физиологические эксперименты свидетельствуют о

функциональности всех типов адренорецепторов (Рис. 6, 7), обнаруженных в

МСК методами молекулярной биологии (α1B-, α2A- и β2-), и отводят α2A-

адренорецептору основную роль в генерации Ca2+ ответов на норадреналин.

14

II.5. Предполагаемый механизм генерации ответов на норадреналин

МСК

Совокупность представленных экспериментальных данных, описанных

выше, позволяет предположить следующие основные этапы механизма

генерации Ca2+ ответа на норадреналин МСК, выделенными из жировой ткани:

активированный при связывании норадреналина α2A-адренорецептор (а в

некоторых случаях и α1B-адренорецептор) посредством G-белка активирует

фосфолипазу C, которая гидролизует PIP2 (фосфатидилинозитол дифосфат) до

IP3 (инозитолтрифосфат) и DAG (диацилглицерол). В свою очередь, IP3

стимулирует IP3-рецепторы, что приводит к первоначальному выбросу

депонированного Ca2+, интенсивность которого зависит от концентрации

агониста. Этот первоначальный Ca2+ сигнал стимулирует масштабный выброс

Ca2+ из внутриклеточных депо, что и продуцирует вторичный Ca2+ ответ, не

зависящий от концентрации агониста (Рис. 13).

III. Пуринергическая сигнальная система МСК

Внеклеточный АТР и продукты его гидролиза эктонуклеотидазами

являются

первичными

медиаторами,

вовлеченными

в

межклеточные

коммуникации

и

паракринные

и

аутокринные

регуляции

в

самых

разнообразных клеточных системах организма (Matsuoka, Ohkubo, 2004;

Burnstock, 2012). К тому же, повреждение биологических тканей ассоциируется

с выбросом большого количества ATP во внеклеточную среду, который может

стимулировать МСК, мигрирующие в зону повреждения. В связи с этим, можно

предположить, что пуринергическая сигнальная система является естественной

частью системы регуляции клеточных функций МСК. Представлялось поэтому

целесообразным проанализировать ответы МСК на пуринергические агонисты.

III.1. Типы пуринорецепторов, обеспечивающие чувствительность

МСК к ATP

Ca2+ ответы на ATP могут генерироваться за счет P2X и P2Y рецепторов.

P2X

рецепторы

являются

ATP-активируемыми

Ca2+-проницаемыми

катионными каналами, а P2Y рецепторы представляют собой GPCR-рецепторы.

Оказалось, что МСК способны генерировать полноценные ответы на ATP в

отсутствии внешнего Ca2+ (Рис. 10B), тем самым указывая, что основной вклад

в генерацию этих ответов вносят P2Y рецепторы. Этот вывод подтверждается

также

тем,

что

МСК

отвечают

и

на

другие

природные

агонисты

пуринорецепторов (Рис. 8), в то время как P2X рецепторы активируются

исключительно

ATP.

Для

идентификации

подтипов

P2Y

рецепторов,

вовлеченных в генерацию ответов на пуринергические агонисты, нами были

15

использованы все существующие на сегодняшний день специфические

агонисты P2Y рецепторов (P2Y1 – MRS 2365; P2Y2 – MRS 2768; P2Y4 – MRS

4062; P2Y6 – MRS 2693; P2Y11 – NF 546). МСК генерировали специфические

Ca2+ ответы на агонисты P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6 рецепторов, агонист же P2Y11

рецептора никогда не стимулировал Ca2+ ответы (Рис. 8).

В соответствии с количественным соотношением субпопуляций МСК,

генерирующих ответы на различные специфические агонисты P2Y рецепторов

(P2Y1 – 51.2%, P2Y2 – 87.2%, P2Y4 – 44.8%, P2Y6 – 2.4%) (Рис. 9), основную

роль в генерации МСК Ca2+-ответов на ATP играют P2Y2, P2Y1 и P2Y4

рецепторы.

Рис. 8. Функциональная экспрессия P2Y рецепторов.

Ответы на природные и специфические агонисты P2Y рецепторов.

Агонисты апплицировали в следующих концентрациях: P2Y1 – MRS 2365, 10 мкM, P2Y2 –

MRS 2768, 10 мкM, P2Y4 – MRS 4062, 10 мкM, P2Y6 – MRS 2693, 10 мкM, P2Y11 – NF 546, 10

мкM, ATP 2 мкM, ADP 2 мкM, UTP 10 мкM, UDP 10 мкM.

Рис. 9. Функциональная экспрессия

подтипов P2Y рецепторов.

Соотношение субпопуляций клеток,

отвечающих

специфические

пуринорецепторов.

16

на

различные

агонисты

III.2. Механизм генерации МСК Ca2+ ответов на ATP

В процессе исследования сигнальной системы МСК, сопряженной с

пуринергическими рецепторами, выяснилось, что механизм генерации Са2+

ответов на агонисты пуринергических рецепторов в крайней степени схож с

механизмом генерации ответов на норадреналин. Этот тезис иллюстрируют

экспериментальные данные, представленные ниже.

В среде с пониженным до цитоплазматического уровня содержанием

Са2+, МСК генерировали нормальные по амплитуде и кинетике ответы на ATP

(Рис. 10B). Следовательно, основной вклад в ответ МСК на АТР вносит выброс

депонированного Са2+, в то время, как вклад P2X рецепторов сводился бы ко

входу наружного Са2+. В присутствии ингибитора фосфолипазы С Са2+ ответы

МСК на ATP полностью подавлялись (Рис. 10A). Предварительная инкубация

МСК в присутствии ингибитора рианодиновых рецепторов не влияла на их

чувствительность к ATP. В противоположность этому антагонист IP3

рецепторов обратимо подавлял ответы на ATP (Рис. 10C). Перечисленные

факты свидетельствуют о том, что генерация Са2+ ответов МСК на ATP

протекает при участии фосфоинозитидного пути.

Рис.

10.

Вклад

фосфоинозитидного

ответы МСК на ATP.

каскада

в

А

Ответы

на

ATP

не

подавляются

неактивным

аналогом

ингибитора

фосфолипазы

C

(U73343),

но

полностью

и

необратимо

подавляются

ингибитором

фосфолипазы С (U73122).

B

Ответы

на

ATP

сохраняются

в

условиях

пониженной концентрации Ca2+ в

наружной среде. Верхняя линия

иллюстрирует

изменение

концентрации внеклеточного Ca2+.

C – Антагонист IP3 рецепторов

(2-APB)

полностью

подавляет

способность генерировать ответы

на ATP, тогда как ингибитор

рианодиновых

рецепторов

(Ryanodine) на нее не влияет.

17

Как и в случае ответов на норадреналин, ответы МСК на ATP

генерировались по принципу “все или ничего” (Рис. 11A). Основываясь на

аналогии с ответами на норадреналин, мы предположили, что ответы на ATP

генерируются при участии механизма CICR. Для доказательства этого нами

были проведены эксперименты по высвобождению внутриклеточного Са2+.

МСК генерировали ответы на скачкообразное повышение концентрации

внутриклеточного Са2+, которые по своей амплитуде и форме были схожи с

ответами на ATP (Рис. 11B). Как и в случае норадреналинергических МСК,

ответы на фотолиз NP-EGTA, не подавлялись ингибитором фосфолипазы C

(Рис. 12A), однако полностью подавлялись в присутствии антагониста IP3

рецепторов (Рис. 12B).

Рис. 11. Зависимость ответов МСК на ATP от его концентрации.

A – Ответы на ATP в различных концентрациях.

B – Сходство кинетики ответов МСК, нагруженной Fluo-4 и NP-EGTA на вспышку

ультрафиолета (UV) и ATP.

18

Рис. 12. Ответы МСК, нагруженной Fluo-4 и NP-EGTA.

A – Ответы на ATP и вспышку UV в присутствии ингибитора фосфолипазы С (U73122).

B – Ответы на вспышку UV в присутствии ингибитора рианодиновых рецепторов

(Ryanodina) и антагониста IP3 рецепторов (2-APB).

III.3. Предполагаемый механизм генерации МСК ответов на ATP

Таким образом, полученные нами данные позволяют предположить, что

механизм, инициируемый внеклеточным ATP и другими агонистами P2Y

рецепторов в цитоплазме МСК, весьма схож с механизмом, инициируемым в

этих клетках норадреналином. Иными словами, при генерации Ca2+-ответов на

ATP

в

МСК

события

происходят

в

следующей

последовательности:

активированный при связывании агониста P2Y рецептор посредством G-белка

активирует фосфолипазу C, которая гидролизует PIP2 до IP3 и DAG. В свою

очередь, IP3 стимулирует IP3-рецепторы, что приводит к первоначальному

выбросу депонированного Ca2+, скорее всего, зависимому от концентрации

агониста. Этот первоначальный Ca2+ сигнал стимулирует масштабный выброс

Ca2+ из внутриклеточных депо, что и продуцирует вторичный Ca2+ ответ, не

зависящий от концентрации агониста (Рис.13).

19

обеспечивающие

первоначальный

агонист-зависимый

IP3Rград

-

IP3-рецепторы,

градуальный Ca2+ сигнал;

IP3RCICR – IP3-рецепторы, активируемые при повышении концентрации внутриклеточного

Ca2+ и участвующие во вторичном, не зависящем от концентрации агониста, выбросе

депонированного Ca2+ (CICR).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа была посвящена исследованию механизмов Ca2+

сигнализации, инициируемой агонистами GPCR рецепторов в цитоплазме

МСК, выделенных из жировой ткани человека, на примере пуринергической и

адренергической сигнальных систем. На данный момент Са2+ сигнализация в

МСК изучена недостаточно. В этой области были выполнены лишь единичные

работы, которые преимущественно посвящены анализу спонтанных Ca2+

осцилляций в цитоплазме МСК и роли внешнего Ca2+ и агонистов некоторых

GPCR рецепторов в развитии и дифференцировке МСК (Ye, 2010; Zippelet al.,

2012).

Выбор пуринергической и адренергической сигнальных систем в качестве

объектов исследования был не случаен. Во-первых, повреждение тканей

приводит к выбросу большого количества ATP во внеклеточную среду,

который может стимулировать МСК, мигрирующие в зону повреждения.

Поэтому можно было ожидать, что пуринергическая сигнальная система

является естественной частью системы регуляции клеточных функций МСК.

Адренергическая система вызывала интерес, поскольку физиологические

процессы во многих периферических тканях, в клетки которых могут

дифференцироваться МСК, модулируются адреналином и норадреналином.

20

Рис. 13. Гипотетическая схема основных внутриклеточных событий, происходящих в МСК

при трансдукции пуринергического и адренергического сигналов. Объяснения в тексте.

Немаловажным обстоятельством было также то, что пуринергические и

адренергические

агонисты

стимулируют

Са2+

сигнализацию

в

самых

разнообразных клетках (Burntock, 2014; Scanzano, Cosentino, 2015).

Проведенное исследование Са2+ сигнализации, инициируемой агонистами

GPCR рецепторов в цитоплазме МСК позволило получить ряд интересных

результатов,

некоторые

из

которых

являются

пионерскими,

судя

по

имеющимся литературным данным. В подтверждение существующих данных о

гетерогенности популяции МСК (Kalinina et al., 2011) в настоящей работе была

продемонстрирована функциональная гетерогенность МСК. Биологическая

значимость этого пока не ясна. Возможно, такая гетерогенность является

косвенным отражением того, что имеются МСК с детерминированной

способностью дифференцироваться в клетки определенного фенотипа.

Основным достижением представленной работы является выяснение

ключевых этапов генерации Ca2+ сигналов при стимуляции МСК агонистами

пурино- и адренорецепторов. Полученные данные свидетельствуют в пользу

того, что пуринергическая и адренергическая трансдукции протекают по

сходному сценарию. Ее интересной особенностью является то, что Ca2+ ответы

МСК, в частности на АТР и норадреналин генерируются по принципу «все или

ничего», т.е. их амплитуда не зависит градуально от концентрации агониста

(Рис. 3, 11). Полученные нами результаты позволяют думать, что в основе этого

феномена лежит двух-стадийная генерация клеточных ответов. На первом этапе

происходит генерация Са2+ сигнала агонист-зависимым образом, который при

участии IP3 рецепторов усиливается по механизму Са2+-индуцированного Са2+

выброса до максимальной амплитуды. И наконец, фармакологический анализ в

сочетании

с

данными

ОТ-ПЦР,

позволил

выявить

типы

пурино-

и

адренорецепторов,

обеспечивающих

чувствительность

МСК

к

соответствующим агонистам. Так, чувствительность МСК к экстраклеточным

нуклеотидам

преимущественно

обеспечивается

P2Y2,

P2Y1

и

P2Y4

пуринорецепторами (Рис. 8, 9), в то время как в трансдукции норадреналина в

основном участвует α2A-адренорецептор (Рис. 6).

Разумеется,

не

все

детали

пуринергической

и

адренергической

сигнализации в МСК окончательно ясны. В частности, роль β2-адренорецептора

в

физиологии

МСК,

который

непосредственно

не

вовлечен

в

Са2+

сигнализацию, еще предстоит установить. Неясно, каким образом IP3

рецепторы могут одновременно обеспечивать первый этап трансдукции,

зависимый от фосфолипазы С, и одновременно участвовать в Са2+-

индуцированном Са2+ выбросе, непосредственно не требующим активной

фосфолипазы С (Рис. 13). Эти и многие другие вопросы требуют своего

разрешения в будущих экспериментах.

21

ВЫВОДЫ

1.

Популяция мезенхимных стромальных клеток (МСК), выделенных

из жировой ткани человека, функционально гетерогенна: в ней сосуществуют

субпопуляции клеток, способные генерировать Са2+ ответы лишь на 1-2

агониста, включая аденозин, АТР, адреналин/норадреналин, ацетилхолин,

глутамат, серотонин, ГАМК.

2.

Основную роль в генерации Са2+ ответов на пуринергические

агонисты в МСК играют метаботропные P2Y рецепторы при несущественном

вкладе

ионотропных

Р2Х

рецепторов.

Основными

рецепторами,

обеспечивающими чувствительность МСК к экстраклеточным нуклеотидам,

являются P2Y1, P2Y2 и P2Y4.

3.

В МСК функционируют α1B-, α2A-, и β2-адренорецепторы, при этом,

за генерацию Са2+ ответов на адренергические агонисты преимущественно

ответственен α2A-адренорецептор.

4.

Ответы МСК на пуринергические и адренергические агонисты

генерируются

за

счет

выброса

депонированного

Са2+

при

участии

фосфоинозитидного каскада. Вклад входа наружного Са2+ пренебрежимо мал.

5.

МСК генерируют ответы на адренергические и пуринергические

агонисты по принципу «все или ничего»: агонист либо не стимулирует

детектируемую мобилизацию цитозольного Са2+ при концентрациях меньше

пороговой, либо вызывает Са2+ ответы практически максимальной амплитуды.

6.

Адренергическая и пуринергическая трансдукции протекают в две

стадии. На первом этапе происходит генерация Са2+ сигнала агонист-

зависимым образом, который затем усиливается по механизму Са2+-

индуцированного выброса Са2+ из внутриклеточных депо до максимальной

амплитуды. Роль Са2+ триггера, запускающего этот регенеративный процесс,

выполняют IP3 рецепторы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах

1.

Котова П.Д., Тюрин-Кузьмин П.А., Рогачевская О.А., Фадеева

Ю.И., Сысоева В.Ю., Ткачук В.А., Колесников С.С. Кальций-индуцированный

выброс депонированного кальция определяет триггерный характер ответов

мезенхимальных стромальных клеток на норадреналин. // Биологические

мембраны. 2013. Т.30(5-6). С.422-429.

22

2.

Kotova P.D., Sysoeva V.Y., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F.,

Kolesnikova A.S., Tyurin-Kuzmin P.A., Fadeeva J.I., Tkachuk V.A., Kolesnikov S.S.

Functional expression of adrenoreceptors in mesenchymal stromal cells derived from

the human adipose tissue. // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell

Research. 2014. 1843. 1899-1908.

3.

Котова П.Д., Фадеева Ю.И., Рогачевская О.А., Сысоева В.Ю.,

Ткачук В.А., Колесников С.С. Пуринергическая сигнализация в мезенхимных

стромальных клетках. // Биологические мембраны. 2015. Т.32(4). С.265-273.

Статьи в сборниках

1.

Котова П.Д., Тюрин-Кузьмин П.А., Рогачевская О.А., Сысоева

В.Ю., Ткачук В.А., Колесников С.С. Усиление ответов мезенхимальных

стволовых клеток на норадреналин посредством кальций индуцированного

выброса

кальция.

//

Международная

конференция

«Рецепторы

и

внутриклеточная сигнализация». Пущино. 2013. Сборник статей, Том 1. С.210-

213.

2.

Котова П.Д., Фадеева Ю.И., Рогачевская О.А., Сысоева В.Ю.,

Ткачук

В.А.,

Колесников

С.С.

Пуринергическая

сигнализация

в

мезенхимальных

стромальных

клетках

человека.

//

Международная

конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация». Пущино. 2015.

Сборник статей, Том 1. С.174-179.

Тезисы докладов:

1.

Котова П.Д., Язев Е.А., Григорьева О.А., Рогачевская О.А. Два типа

кальциевых ответов мезенхимальных стволовых клеток на норадреналин. // 16

Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология –

Наука XXI века». Пущино, Россия 16-21 апреля 2012. Сборник тезисов. С. 57-

58.

2.

Котова П.Д., Язев Е.А., Григорьева О.А., Рогачевская О.А., Сысоева

В.А., Ткачук В.А., Колесников С.С. Механизмы генерации Са2+ ответов на

норадреналин мезенхимальными стволовыми клетками человека. // IV Съезд

биофизиков России. Н.Новгород, Россия, 20-26 августа 2012. Материалы

докладов. С.152.

3.

Котова П.Д., Колесникова А.С., Фадеева Ю.И., Агеева Л.В., Тюрин-

Кузьмин П.А., Сысоева В.Ю., Рогачевская О.А. Кальций индуцированный

выброс кальция как механизм усиления ответов мезенхимальных стволовых

клеток человека на норадреналин. // 17 Международная Пущинская школа-

конференция молодых ученых «Биология – Наука XXI века». Пущино, Россия

21-26 апреля 2013. Сборник тезисов. С. 425-426.

4.

Котова П.Д., Фадеева Ю.И., Тюрин-Кузьмин П.А., Рогачевская

О.А., Сысоева В.А., Ткачук В.А., Колесников С.С. Механизмы генерации Са2+

23

ответов на норадреналин мезенхимальными стромальными клетками человека.

// V Всероссийская научно-практическая конференция «Стволовые клетки и

регенеративная медицина». Россия, Москва, 18-21 ноября 2013 года. Сборник

тезисов, С. 36.

5.

Фадеева Ю.И., Тюрин-Кузьмин П.А., Сысоева В.Ю., Котова П.Д.,

Рогачевская О.А., Колесников С.С., Ткачук В.А. Субпопуляция гетерогенной

культуры МСК, отвечающая по механизму кальций-индуцированного выброса

кальция. // V Всероссийская научно-практическая конференция «Стволовые

клетки и регенеративная медицина». Россия, Москва, 18-21 ноября 2013 года.

Сборник тезисов, С. 74.

6.

Котова П.Д., Колесникова А.С, Фадеева Ю.И., Агеева Л.В.,

Рогачевская О.А., Сысоева В.А. Две ключевые стадии Са2+ сигнализации,

инициируемой адренергическими агонистами в мезенхимальных стромальных

клетках. // 18 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых

«Биология – Наука XXI века». Пущино, Россия 21-25 апреля 2014. Сборник

тезисов. С. 343-344.

7.

Тарасов М.В., Котова П.Д., Рогачевская О.А., Сысоева В.Ю.

Идентификация К+каналов TREK-2 в мезенхимальных стромальных клетках

человека. // 18 Международная Пущинская школа-конференция молодых

ученых «Биология – Наука XXI века». Пущино, Россия 21-25 апреля 2014.

Сборник тезисов. С. 120-121.

8.

П.Д.

Котова,

Ю.И.

Фадеева,

П.А.

Тюрин-Кузьмин,

О.А.

Рогачевская, В.Ю. Сысоева, В.А. Ткачук, С.С. Колесников. Са2+ сигнализация в

адренергических мезенхимальных стромальных клетках. // Научные труды IV

съезда физиологов СНГ. Сочи – Дагомыс, Россия 8-12 октября 2014. Сборник

тезисов. С.27-28.

9.

Котова П.Д., Фадеева Ю.И., Агеева Л.В., Рогачевская О.А., Сысоева

В.Ю. Кальциевая сигнализация, инициируемая пуринэргическими агонистами в

мезенхимальных стромальных клетках человека. // 19 Международная

Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – Наука XXI

века». Пущино, Россия 20-24 апреля 2015. Сборник тезисов. С. 337.

10.

Tyurin-Kuzmin P.A., Sysoeva V.Y., Fadeeva J.I., Ageeva L.V., Kalinina

N.I., Sharonov G.V., Rubtsov Y.P., Kotova P.D., Kolesnikov S.S., Tkachuk V.A.

Functionally distinct subpopulations of human adipose-derived mesenchymal stromal

cells express different subtypes of adrenergic receptors. // ICCSR Annual meeting.

Stockholm, Sweden, June 24-27 2015. Abstract book. P. 417-418.

24



Похожие работы:

«Матафонова Галина Георгиевна КОМБИНИРОВАННЫЕ ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ЗАЩИТЫ ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ ОТ ОРГАНИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ И ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫХ ЭКСИЛАМП Специальность 03.02.08 – Экология (химия) (химические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Улан-Удэ – 2015 доктор биологических наук, профессор Батоев Валерий Бабудоржиевич Научный консультант: Официальные оппоненты: Лебедева Ольга...»

«КОЧКОНЯН Анжела Суреновна ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ У ДЕТЕЙ СО СЪЁМНОЙ ОРТОДОНТИЧЕСКОЙ АППАРАТУРОЙ 03.01.04 – биохимия 14.01.14 – стоматология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Краснодар – 2015 Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации...»

«КУЗЬМИНА УЛЬЯНА ШАФКАТОВНА РЕГУЛЯЦИЯ NMDA-РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2015 Доктор биологических наук Доктор медицинских наук Доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО Башкирский государственный университет, г. Уфа Доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник ФГБНУ Научный центр неврологии,...»





 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.