авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

На правах рукописи

Белова Оксана Андреевна

Вирусологические и паразитологические аспекты оценки

локального риска заражения в очаге клещевого энцефалита

03.02.02 – вирусология

03.02.11 – паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

МОСКВА – 2015

доктор медицинских наук, профессор,

ФГБНУ «Научно-исследовательский

институт эпидемиологии и микробиологии

имени Г.П. Сомова»,

главный научный сотрудник

доктор биологических наук, ФБУН

"Научно-исследовательский институт

дезинфектологии" Роспотребнадзора,

ведущий научный сотрудник

Леонова Галина Николаевна

Шашина Наталья Игоревна

Ведущая организация:

ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский

центр

эпидемиологии

и

микробиологии

имени

почетного

академика

Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России

Защита состоится 25 декабря 2015г. в 11 часов 00 минут на заседании

диссертационного

совета

Д

001.026.01

на

базе

ФГБНУ

«Институт

полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» по адресу:

142782,

город

Москва,

поселение

Московский,

поселок

Института

полиомиелита, 27 км Киевского шоссе.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального

государственного бюджетного научного учреждения «Институт полиомиелита

и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» и на сайте http://poliomyelit.ru.

Автореферат разослан «____» __________ 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Романова Лидия Юрьевна

2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном

учреждении «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени

М.П. Чумакова»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

Карганова Галина Григорьевна

кандидат биологических наук

Буренкова Людмила Анатольевна

Официальные оппоненты:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Клещевой энцефалит (КЭ) представляет серьезную проблему для

всемирного здравоохранения как наиболее значимая по последствиям из

переносимых иксодовыми клещами инфекций. Для понимания механизмов

функционирования паразитарной системы требуются фундаментальные знания

о физиологии клещей, свойствах вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и

взаимном влиянии клеща и вируса. Актуальность данной работы заключается в

необходимости получения новой и осмыслении известной информации о

вирусологических и паразитологических аспектах оценки локального риска

заражения в природных очагах КЭ.

Степень разработанности темы

На момент выполнения данной работы уже проведено большое количество

исследований, направленных как на изучение свойств самого природного очага

КЭ, так и на анализ характеристик членов паразитарной системы «возбудитель-

переносчик-прокормитель» и взаимоотношений между ними. Подробно

изучена биология, экология и эпидемиологическое значение иксодовых клещей

и ВКЭ. Исследованы некоторые аспекты взаимного влияния организма клеща и

ВКЭ, в частности были получены данные, указывающие на влияние

зараженности клещей ВКЭ на их поведение и физиологические процессы

(Алексеев и др., 1988, 1992; Коротков и Буренкова, 2006), а для ВКЭ было

показано разное селективное давление на вирусную

популяцию при

репродукции в клещах и млекопитающих (Дживанян и др., 1986, 1988, 1991;

Labuda et al., 1994; Romanova et al., 2007; Ruzek et al., 2008; Khasnatinov et al.,

2009). Несмотря на большой объем накопленных данных, для понимания

механизмов, определяющих связь различных характеристик биоценоза со

свойствами циркулирующего ВКЭ, которые в свою очередь определяют

активность локального очага, необходимы дополнительные комплексные

вирусологические и паразитологические исследования функционирования

паразитарной системы «ВКЭ-иксодовые клещи-прокормитель».

3

Цель и задачи исследования

Целью

данной

работы

было

изучение

паразитологических

и

вирусологических аспектов оценки локального риска заражения в природных

очагах

КЭ.

Были

сформулированы

следующие

задачи:

1)

оценить

эффективность

детекции

ВКЭ

в

иксодовых

клещах

разных

видов

современными

методами,

применяемыми

в

эпидемиологических

исследованиях;

2)

изучить

влияние

физиологического

состояния

и

зараженности ВКЭ клещей на их поисковую активность и оценить эти

характеристики природных популяций клещей из сходных и удаленных друг от

друга мест обитания; 3) исследовать возможность влияния растений разных

видов на распределение иксодовых клещей в биотопе; 4) сравнить динамику

размножения ВКЭ при острой и персистентной инфекции в клещах разных

видов и в перевиваемых культурах клеток клещей; 5) изучить свойства

вариантов ВКЭ, адаптированных к острой и персистентной инфекции в клещах

разных видов, а также в перевиваемых культурах клеток клещей.

Научная новизна

Впервые: - изучена динамика репродукции ВКЭ в клещах – основных и

второстепенных переносчиках вируса – при различных методах заражение и

при разных условиях (комнатная и повышенная температура, в голодных и

питающихся

клещах);

-

исследовано

влияние

зараженности

ВКЭ

и

физиологического

возраста

клещей

на

их

поисковую

активность

и

чувствительность к репелленту ДЭТА; - показано, что при достаточной

влажности иксодовые клещи разных видов (Ixodes ricinus и I. persulcatus)

реагируют на некоторые запахи растительного происхождения сходным

образом, тогда как реакция клещей одного вида из удаленных друг от друга

регионов

на

некоторые

растительные

экстракты

может

значительно

различаться; - исследованы характеристики острой и хронической инфекции

ВКЭ в клещах и перевиваемых культурах клеток клещей (основных и

второстепенных переносчиков вируса) и проведено изучение свойств вариантов

вируса, имеющих селективное преимущество в данных системах; - проведен

«слепой» эксперимент по изучению эффективности детекции ВКЭ в клещах

методами ИФА и ПЦР в реальном времени с использованием существующих

4

коммерческих тест-систем и лабораторно зараженных и незараженных вирусом

иксодовых клещей разных видов и фаз развития.

Теоретическая и практическая значимость работы

В работе на большом фактическом материале с использованием иксодовых

клещей разных видов на модели ВКЭ получены новые экспериментальные

данные, которые вносят вклад в решение фундаментальной проблемы о

взаимодействии паразитарной системы клещ – ВКЭ. В ходе работы было

сделано следующее: выбран наиболее эффективный метод лабораторного

заражения клещей ВКЭ; показана зависимость от местообитания реакции

иксодовых клещей одного вида на растительные экстракты; показано

решающее влияние влажности окружающей среды на поведение иксодовых

клещей; проведена оценка локального риска заражения в разных районах

Республики Карелия в период массовой активности клещей; исследовано

соотношение иксодид разного физиологического возраста в период их

массовой активности в отдаленных друг от друга регионах; исследовано

влияние физиологического возраста клещей на их поисковую активность;

доказано

влияние

зараженности

клещей

ВКЭ

на

их

активность

и

чувствительность

к

репелленту

ДЭТА;

продемонстрирована

подробная

динамика размножения ВКЭ в клещах при разных температурных режимах, а

также при питании клещей на животном; описана персистентная инфекция ВКЭ

клещей рода Ixodes и Dermacentor, а также культуры клеток клещей и изучены

свойства вариантов вируса, адаптированного к данным системам. Таким

образом, в ходе работы были исследованы различные аспекты взаимодействия

между иксодовыми клещами и ВКЭ, что имеет большую теоретическую

значимость. Практическая значимость работы заключается в исследовании

эффективности современных методов детекции ВКЭ в иксодовых клещах и в

изучении различных факторов, влияющих на локальный риск заражения ВКЭ в

природном очаге. Это важно при оценке потенциальной опасности природных

очагов КЭ и выборе необходимого объема, времени и места проведения

профилактических мероприятий. Полученные данные позволили научно

обосновать известный факт, что зараженность ВКЭ клещей, снятых с людей и

животных, значительно выше, чем при сборе в природе с растительности.

5

Внедрение результатов исследования

Полученные в ходе работы результаты вошли в курс лекций по

арбовирусам на биологическом факультете в МГУ им. М.В. Ломоносова, а

также в курс лекций по вирусологии в ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России.

Методология и методы исследования

Для исследования взаимовлияния между клещами и ВКЭ необходимо

было проведение модельных экспериментов с заведомо зараженными особями,

для чего был осуществлен анализ лабораторных методов заражения клещей

вирусом. Поисковую активность клещей оценивали согласно стандартной

методике определения эффективности репеллентов (Методы определения

эффективности…, 2004). Для изучения реакции иксодовых клещей на

различные растительные экстракты использовали методику, разработанную

А.В. Мишиным (1958) и модифицированную нами. Работу с ВКЭ проводили с

использованием стандартных вирусологических, молекулярно-биологических и

серологических методов.

Личный вклад автора

Автор данной работы входила в состав экспедиций сотрудников ФГБНУ

ИПВЭ им. М.П. Чумакова по сбору полевого материала. Исследования

популяций клещей в Республике Карелия проводили совместно с сотрудниками

института биологии Карельского научного центра РАН. Все акарологические и

вирусологические исследования и работа с перевиваемыми культурами клеток

клещей

проведены

автором

самостоятельно.

Работа

по

определению

нуклеотидной последовательности участков генома ВКЭ была проведена

автором совместно с м.н.с. ФГБНУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова А.Г. Литовым.

Положения, выносимые на защиту

1. ВКЭ способен размножаться, достигать высоких титров и формировать

персистентную инфекцию как в клещах - основных переносчиках вируса, так

и в клещах, таковыми не считающимися. Уровень репродукции ВКЭ в

иксодовых

клещах

зависит

от

температуры

окружающей

среды

и

значительно повышается при их питании.

2. Адаптация ВКЭ к острой инфекции в основных и второстепенных клещах-

переносчиках вируса, а также к персистентной инфекции в перевиваемых

6

культурах клеток клещей приводит к повышению гетерогенности вирусной

популяции

и

появлению

в

ней

вариантов

ВКЭ

со

сниженной

нейроинвазивностью. При персистентной инфекции ВКЭ в клещах разных

видов отмечено повышение гетерогенности популяции без быстрого отбора

подобных мутантов.

3. В период массовой активности клещей соотношение особей разного

физиологического возраста в природных популяциях различается не только в

удаленных друг от друга регионах, но и в районах с похожими ландшафтно-

климатическими условиями.

4. Клещи, зараженные ВКЭ, более активны и толерантны к воздействию

репеллента ДЭТА, чем незараженные клещи. Наиболее высокой поисковой

активностью среди самок I. ricinus обладают особи IV физиологического

возраста.

5. На распределение клещей в биотопах существенное влияние оказывают

относительная влажность воздуха, видовой состав растений и регион

местообитания клещей.

6. ПЦР в реальном времени является более чувствительным и оптимальным чем

ИФА методом оценки зараженности иксодовых клещей ВКЭ.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных данных подтверждается использованием

большого числа клещей и стандартных, строго контролируемых условий при

проведении

экспериментов,

а

также

большим

объемом статистически

обработанного

фактического

материала.

Материалы

диссертации

были

представлены на 7 международных, 4 отечественных и 5 всероссийских

конференциях с международным участием, а также на 3 межлабораторных

конференциях молодых ученых.

Автором получены следующие премии: награда за лучшую работу в

области клещевых инфекций среди молодых ученых на XI International Jena

Simposium on Tick-borne Diseases (Weimar, 2011); награда за лучший постерный

доклад на Международной конференции «Молекулярная эпидемиология

актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2013).

7

Публикации

По теме диссертации опубликованы 9 научных статей: 3 – в российских

журналах, входящих в Перечень изданий, рекомендованных ВАК, 3 – в

зарубежных

журналах,

индексируемых

в

международных

системах

цитирования (Web of Science, Scopus, PubMed), 3 – в прочих изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертация построена по стандартному плану, изложена на 200

страницах

текста

и

включает

в

себя

32

таблицы

и

32

рисунка.

Библиографический указатель содержит 334 источника литературы: 168

отечественных и 166 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Исследования проводились с использованием культуры клеток почек

эмбриона свиньи версенизированной (СПЭВ) и перевиваемых культур

клещевых

клеток

HAE/CTVM8

(Hyalomma

anatolicum

anatolicum)

и

IRE/CTVM19 (Ixodes ricinus), предоставленных доктором Lesley Bell-Sakyi (The

Tick Cell Biobank, The Pirbright Institute) как описано ранее (Bell-Sakyi, 1991;

Bell-Sakyi et al., 2007; Romanova et al., 2007). В работе использовали штаммы и

варианты ВКЭ из лабораторной коллекции.

Сбор

клещей,

использованных

в

экспериментах,

проводили

по

стандартной методике при помощи флага (Сбор, учет и подготовка…, 2002).

Всего в опытах было использовано около 2500 клещей 5 видов – I. ricinus,

I. persulcatus,

D. reticulatus,

D. marginatus

и

D. nuttalli

из

Калужской,

Смоленской областей, Ставропольского края, Карачаево-Черкессии, Республик

Карелия и Тыва. Кормление клещей и определение эффективности репеллента

ДЭТА проводили по стандартным методикам (Методы лабораторного

культивирования…, 2004; Методы определения эффективности…, 2004).

Физиологический возраст (ФВ) клещей определяли по методике, разработанной

И.В. Разумовой (2001). Для изучения реакции иксодовых клещей на различные

растительные экстракты использовали модифицированную методику А.В.

Мишина (1958). Наличие вируса в клещах определяли методами ИФА и ПЦР в

реальном времени (Белова и др., 2014). Работу с ВКЭ проводили с

8

использованием стандартных вирусологических, молекулярно-биологических и

серологических методов.

Результаты и обсуждение

Локальный риск заражения в очаге КЭ характеризует эпизоотическое

состояние и потенциальную опасность природных очагов в определенном месте

и зависит от численности и зараженности клещей ВКЭ, от видовых и

физиологических особенностей популяции клещей, а также от свойств

вирусной популяции.

Для исследования взаимовлияния между клещами и ВКЭ необходимо

проведение модельных экспериментов с заведомо зараженными клещами. Для

выбора оптимального метода заражения клещей I. ricinus, I. persulcatus, D.

reticulatus D. marginatus и D. nuttalli заражали штаммом ЭК-328 или Абсеттаров

ВКЭ тремя методами: перкоксальным, ректальным или методом погружения в

вирусную суспензию. Методы оценивали по следующим показателям:

травматичность, эффективность заражения, динамика размножения вируса в

клещах. Наивысшую эффективность заражения половозрелых клещей показали

перкоксальный и ректальный методы (100%), что статистически достоверно

отличалось от результатов метода погружения в вируссодержащую КЖ (50-

75%, р0,001). ВКЭ достигал наибольших титров и размножался интенсивнее

всего в перкоксально зараженных клещах. Опираясь на полученные результаты

в

дальнейших

исследованиях

заражение

взрослых

клещей

проводили

перкоксальным методом.

1. Исследование эффективности детекции ВКЭ в иксодовых клещах

Одним из основных критериев оценки локального риска заражения

является уровень зараженности клещей ВКЭ. Для оценки последнего

необходимо учитывать эффективность метода, используемого для выявления

вируса. В настоящее время выявление ВКЭ в клещах проводят методами ИФА,

ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени. Согласно литературным данным,

показатели зараженности клещей, полученные разными методами, существенно

различаются.

В

связи

с

этим

мы

провели

сравнительную

оценку

чувствительности и специфичности ИФА и ПЦР с детекцией в реальном

времени. Из перкоксально зараженных штаммом ЭК-328 или штаммом

9

Абсеттаров ВКЭ клещей и незараженных особей I. ricinus, I. persulcatus, D.

reticulatus, D. marginatus и D. nuttalli формировали зашифрованные серии и

отправляли производителям коммерческих тест-систем (ЗАО «Вектор-Бест» и

ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Аналогичные эксперименты проводили с

питавшимися в течение 3 дней клещами I. ricinus и D. marginatus. Были

получены

следующие

результаты:

эффективность

детекции

ВКЭ

исследованными тест-системами не зависела от пола и вида зараженного

клеща; тест-системы на основе ИФА и ПЦР в реальном времени показали 100%

эффективность

детекции

ВКЭ

в

полунапитавшихся

клещах,

ложноположительных реакций выявлено не было; метод ИФА оказался менее

чувствительным, чем ПЦР в реальном времени (процент ложноотрицательных

результатов составил для ИФА 12,5% против 0,4% для ПЦР в реальном

времени); отмечена зависимость чувствительности ИФА от субтипа ВКЭ (при

дозе обоих штаммов ВКЭ 4 lgБОЕ/клещ доля ложноотрицательных результатов

при заражении клещей ЭК-328 – 5,9%, а для Абсеттаров – 38,9%); отмечена

зависимость чувствительности и специфичности ИФА от протокола проведения

анализа; при использовании для суспендирования клещей среды 199 на

растворе Эрла вместо раствора для разведения образцов из набора,

чувствительность тест-системы на основе ИФА снижается до 36-40%.

2. Исследование физиологического состояния и поведения половозрелых

иксодовых клещей из природных популяций

Одними из необходимых критериев при оценке риска заражения ВКЭ в

локальном очаге являются физиологическое состояние и активность клещей из

природной популяции. Физиологическое состояние клеща может определять

такие важные параметры как жизнеспособность, активность и агрессивность

клеща, восприимчивость к ВКЭ, скорость и интенсивность размножения вируса

в организме клеща, частоту и обильность слюноотделения, эффективность

трансовариальной передачи ВКЭ (Балашов, 1961; Хижинский, 1968; Мишаева,

Вотяков, 1978; Алексеев и др., 1988; Uspensky, 1995). В зависимости от вида

клеща, региона и периода наблюдения состав и соотношение особей разных ФВ

в популяции отличается (Балашов, 1961; Хижинский, 1968; Успенский и

Репкина, 1974; Разумова, 1992).

10

В данной работе мы сравнили активность и соотношение особей разного

ФВ в природных популяциях клещей I. persulcatus из Республик Карелия и

Тыва, а также I. persulcatus и I. ricinus из Московской области в период их

массовой активности. Соотношение иксодовых клещей разного ФВ различалось

не только в удаленных друг от друга регионах, но также и в районах с

похожими ландшафтно-климатическими условиями. Во всех исследованных

популяциях клещей в период массовой весенней активности иксодид

превалировали особи III ФВ. За 1-2 недели соотношение клещей различного ФВ

в природной популяции может значительно измениться. Таким образом, при

использовании

оценки ФВ как фактора локального риска заражения

необходимо его исследование отдельно для каждой точки.

В серии опытов было исследовано влияние ФВ клещей на их реакцию на

репеллент широкого спектра действия ДЭТА. Поисковую активность клещей

оценивали по средней высоте подъема иксодид за 3 минуты по ткани,

обработанной

нарастающими

концентрациями

репеллента,

к

руке

экспериментатора. Клещи I. persulcatus были более активными, чем I. ricinus,

при этом самки первого вида проявляли большую активность по сравнению с

самцами (р=0,002) (Рисунок 1). У I. ricinus были выявлены статистически

достоверные различия в реакции клещей III и IV ФВ на ДЭТА, где самки IV ФВ

были более активными (Рисунок 1).

В

литературе

имеются

данные,

указывающие

на

то,

что

при

инфицировании

клещей

ВКЭ

происходит

усиление

их

двигательной

активности, обостряется реакция на запах потенциального хозяина (Алексеев и

др., 1988; 1991). Наличие ВКЭ в организме специфического переносчика может

быть

причиной

физиологической

перестройки

организма

клещей,

регулирующей ход линочных процессов, индукцию и прекращение диапаузы

(Коротков, Буренкова, 2006). В своей работе мы исследовали поисковую

активность незараженных I. ricinus и клещей, перкоксально зараженных

штаммом Абсеттаров ВКЭ. В наших экспериментах только зараженные особи

преодолевали участок ткани, обработанный 1%-ным раствором ДЭТА (расход

1 мл/см2), и поднимались по ткани к руке экспериментатора достоверно выше,

чем незараженные клещи (Рисунок 2). Наиболее высоко по обработанной

11

ДЭТА ленте поднимались самки IV ФВ как в зараженной ВКЭ, так и в

незараженной группе (р=0,03) (Рисунок 2).

35

30

25

20

15

10

5

0

Самцы

Самки

Самки III ФВ Самки IV ФВ

I. persulcatus (Республика Тыва)

I. persulcatus (Республика Карелия)

I. ricinus (Лабораторная культура; Калужская область)

Рисунок 1. Средняя высота подъема половозрелых клещей I. ricinus из

Калужской области и I. persulcatus из Республик Тыва и Карелия по ленте,

обработанной разными концентрациями ДЭТА, к руке экспериментатора.

35,0

30,0

25,0

20,0

15,0

10,0

5,0

0,0

Зараженные клещи Интактные клещи

самки III ФВ

самки IV ФВ

самцы

Рисунок 2. Средняя высота подъема по ленте, обработанной разными

концентрациями ДЭТА, зараженных ВКЭ и незараженных самок III и IV

физиологического возраста и самцов клещей I. ricinus.

Таким образом, в экспериментах с I. ricinus был доказан факт повышения

активности и толерантности к репелленту ДЭТА у зараженных ВКЭ клещей, а

также факт наиболее высокой активности самок IV ФВ. Последнее позволяет

12

предположить, что анализ физиологического состояния природных популяций

клещей является важным не только для экологических исследований, но и для

оценки риска заражения в локальных очагах КЭ.

3. Неоднородность обилия и зараженности ВКЭ иксодовых клещей на

примере иксодофауны Республики Карелия

Для оценки локального риска заражения в природных очагах КЭ были

предложены различные показатели. Наиболее важными из них считают

численность клещей и долю особей, заражённых вирусом (Бабенко и др., 1962;

Коренберг, 1981). Необходимо учитывать также особенности сезонного хода

активности, жизненного цикла и физиологического состояния клещей

определенного вида и неравномерность распределения иксодовых клещей

(Коренберг, 1979; Окулова, 1982; Коротков и Кисленко, 1997). В очагах КЭ

именно «ядра популяции» имеют главное эпидемиологическое значение. В

наших исследованиях доля зараженных I. persulcatus в разных районах Карелии

(2008-2009 гг.) варьировала от 0,6 до 6,7%. При этом мы получили

положительную корреляцию между численностью клещей и их заражённостью

ВКЭ, что является следствием существования активного очага КЭ на данной

территории и в данный момент. На примере Республики Карелия нами было

показано, что показатель заболеваемости КЭ достоверно не отражает

локальный риск заражения. Для правильного анализа последнего необходимо

не только проводить оценку обилия и зараженности клещей ВКЭ, но и

учитывать пространственное строение очагов КЭ и распределение в нем

клещей.

Одной из причин неравномерного распределения клещей в биотопе может

являться воздействие на них летучих веществ, выделяемых растениями. В

своих экспериментах мы изучили реакцию клещей I. persulcatus из Республики

Карелия на запахи растений, доминирующих и редких в биотопах с высокой

численностью этих клещей и сравнили с реакцией клещей этого же вида из

Республики Тыва и I. ricinus из лабораторной культуры. Основными

факторами, определяющими реакцию иксодид, являются влажность среды,

регион обитания клещей и вид растительного запаха. Клещи разных видов и

пола реагировали на один и тот же запах сходным образом, при этом реакции

13

при комнатной и повышенной (32-37°С) температурах,

питающихся на кролике (Рисунок 3).

7,0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0,0

а также в клещах,

ВКЭ размножался достоверно быстрее и достигал наиболее высоких

титров как в клещах при питании, так и в клещах при повышенной температуре

(32-37°С) по сравнению с голодными клещами, находящимися при комнатной

температуре (Рисунок 3). При питании клещей начало подъема титров вируса

произошло на 6 часов раньше и сами титры были почти всегда выше, чем в

14

клещей I. persulcatus из Республик Тыва и Карелия на некоторые запахи (в

особенности на чернику и бруснику) значительно различались.

4. Размножение ВКЭ в иксодовых клещах разных видов

В литературе имеются данные, указывающие на более высокую

зараженность

полунапитавшихся

клещей

по

сравнению

с

голодными

(Мельникова

и

др.,

1997).

Некоторыми

учеными

были

получены

первоначальные данные, говорящие о быстром размножении ВКЭ при питании

клещей (Коренберг и Пчелкина, 1984; Khasnatinov et al., 2009). В своей работе

мы подробно проанализировали влияние процесса питания клеща на скорость и

интенсивность размножения ВКЭ в голодных клещах. Для этого мы сравнили

динамику накопления ВКЭ штамма Абсеттаров в голодных клещах I. ricinus

0

6

12

18

24

30

48

53

63

72

96 111 168 216

Часов после заражения клещей

комната, 23°C

питание на кролике

37°С

32°С

Термостат:

Рисунок 3. Динамика размножения штамма Абсеттаров ВКЭ в голодных

клещах I. ricinus при

питающихся на кролике.

комнатной температуре, при 32-37°С, и в клещах,

голодных клещах, содержащихся при повышенной температуре. Таким

образом, наибольшие титры и интенсивность размножения вируса наблюдалась

при питании клещей, что подчеркивает целесообразность наиболее быстрого

изъятия клеща из кожи при его присасывании.

4.1. Адаптация ВКЭ к острой и персистентной инфекции в клещах и

культурах клеток клещей

Наиболее эпидемиологически значимым свойством вирусной популяции

является нейроинвазивность вируса. Для многих флавивирусов, в том числе и

ВКЭ, описаны варианты, имеющие в поверхностном белке Е мутации,

приводящие к повышению локального положительного заряда и аффинности к

гликозаминогликанам (ГАГ) клетки, и обладающие так называемым ГАГ-

связывающим фенотипом, для которого характерны мелкобляшечный фенотип

в культуре клеток почки свиньи, сниженная нейроинвазивность для мышей и

часто отсутствие гемагглютинации (ГА). Было показано, что подобные мутанты

селектируются при адаптации ВКЭ к клещам разных видов. Так, при адаптации

используемого нами штамма ЭК-328 к острой инфекции в клещах Hyalomma

marginatum (17 парентеральных пассажей) был получен вариант М с

характерными заменами в белке Е и ГАГ-связывающим фенотипом (Romanova

et al., 2007).

В своей работе мы изучали свойства популяции ВКЭ, адаптированной к

острой и персистентной инфекции в клещах и культурах клеток основных и

второстепенных переносчиков вируса.

Для адаптации штамма ЭК-328 к острой инфекции в клещах разных видов,

были проведены серии пассажей в клещах рода Ixodes и Dermacentor. Для

первоначального заражения клещей мы использовали штамм ЭК-328 в виде КЖ

инфицированных клеток СПЭВ. Стоит отметить, что после размножения этого

вируса в мозге мышей нейроинвазивность вируса повысилась (Таблица 1).

Адаптация штамма ЭК-328, выявляемая как повышение титров вируса в

процессе пассирования в клещах, прослеживалась в клещах I. ricinus и D.

reticulatus на протяжении 6 пассажей и в I. persulcatus на протяжении 3

пассажей (Таблица 1). Гетерогенность бляшек, образуемых ВКЭ на культуре

клеток СПЭВ, т.е. изменение состава вирусной популяции, была заметна уже со

15

Вирулентность для мышей

при i/p введении вируса

LD50,

Титр ВКЭ,

(lgБОЕ в 1

мл КЖ или

1%-ой КС)

Размер

бляшек*,

мм

8-10

8-10

3-4

4-5

Вариант

Пассажная

вируса

история

исходный штамм ЭК-328 в

виде КЖ клеток СПЭВ

исходный штамм ЭК-328 в

виде мозговой суспензии

тв1011

4 пассажа на

линия 1

I. ricinus

тв1012

4 пассажа на

линия2

I. ricinus

выраженное в

БОЕ (в скобках

указаны lg)

50 (1,7±0,3)

5 (0,7±0,6)

6 (0,8)

6 (0,8)

500 (2,7)

lgLD50/ мл

7,3±0,3

5,1±0,6

n=10

n=5

8,9±0,2

7,4±0,4

n=9

n=7

5,6

5,1

6,2

3,4

4,3

5

4,4

3,4

6 пассажей на

10:(1,5-2,5)

I. ricinus

мм = 5:8

тв1090

тв1092

тв1003

тв1015

тв1020

тв1098

3 пассажа на

I. persulcatus

2 пассажа на

D. silvarum

4 пассажа на

D. reticulatus

8-10

8-10

2-го пассажа (Таблица 1).

Таблица 1. Свойства вариантов штамма ЭК-328, адаптированных к острой

инфекции в клещах разных видов.

4-5

2

5 пассажей на

1,5:3 мм =

D. reticulatus

1:1

7 пассажей на

6:3:1 мм =

D. reticulatus

13:13:10

3,8

5

2

300 (2,5)

* размер бляшек оценивали на 7-ой день после заражения культуры клеток

СПЭВ; n – количество проделанных независимых экспериментов; КС –

клещевая суспензия; nd – нет данных

Для некоторых вариантов, адаптированных к иксодидам разных видов, мы

оценили

нейроинвазивность

для

лабораторных

мышей

при

интраперитонеальном (i/p) введении вируса. Адаптация штамма ЭК-328 ВКЭ к

острой инфекции до 4-го пассажа в клещах разных видов приводила в целом к

повышению вирулентности варианта для мышей до показателей, характерных

для исходного штамма ЭК-328 после размножения в клетках ЦНС. При более

длительной адаптации: после 6-и пассажей штамма ЭК-328 в клещах I. ricinus и

7 пассажей в D. reticulatus – нейроинвазивность вирусной популяции

16

nd

nd

3,6

7 (0,85)

nd

nd

nd

nd

снижалась. Полученные данные показывают, что при острой инфекции в

клещах

разных

видов,

которые

являются

и

не

являются

основным

переносчиком ВКЭ, селективным преимуществом обладают варианты со

сниженной нейроинвазивностью.

Таким образом, при адаптации штамма ЭК-328 ВКЭ к острой инфекции в

иксодовых клещах разных видов наблюдался отбор вариантов со сниженной

нейроинвазивностью.

Далее мы попытались получить адаптированные к клещам варианты с

длительной персистенцией в их организме. Для этого мы

заражали

парентерально клещей I. ricinus, I. persulcatus и D. reticulatus из лабораторных

культур штаммами ЭК-328 и Абсеттаров ВКЭ. В разные сроки после

инфицирования в течение 5 месяцев мы отбирали несколько особей каждого

вида и определяли титр ВКЭ в клещевых суспензиях методом бляшек. Для

клещей I. persulcatus период наблюдения составил 54 дня в связи с их высокой

смертностью

в

лабораторных

условиях.

Оба

штамма

ВКЭ

успешно

размножались и были способны длительно персистировать во всех 3 видах

клещей. Самые высокие титры штамма ЭК-328 наблюдались в клещах D.

reticulatus в течение всего периода наблюдения. Штамм Абсеттаров достиг

наивысших титров в клещах I. ricinus, однако на некоторые сроки количество

инфекционного вируса было достоверно выше в клещах D. reticulatus.

При анализе фенотипа бляшек штамма ЭК-328 при адаптации к

персистентной инфекции в клещах мы наблюдали проявление гетерогенности

вирусной популяции только на наиболее поздние сроки (Таблица 2).

Гетерогенность популяции по бляшкам отмечалась практически на всех

анализируемых точках, но соотношение вариантов с разным бляшечным

фенотипом все время изменялось. Все исследованные варианты, обладали

повышенной нейроинвазивностью для мышей, сходной с таковой штамма ЭК-

328, полученного при размножении в мозге мышей (Таблица 2).

Для

оценки

возможного

изменения

характеристик

вируса,

персистирующего в нехарактерном для него переносчике, клещей D. reticulatus

на 128-ой день после заражения ВКЭ сажали на кроликов для питания. При

этом были получены варианты с аналогичными свойствами.

17

LD50,

выраженное

в БОЕ (в

скобках lg)

50 (1,7±0,3)

5 (0,7±0,6)

Вариант

вируса

lgLD50/мл

5,1±0,6

n=5

7,4±0,4

n=7

Размер

Титр

Пассажная история

бляшек,

ВКЭ,

мм

lgБОЕ/мл

исходный штамм ЭК-328 в виде

КЖ клеток СПЭВ

исходный штамм ЭК-328 в виде

мозговой суспензии

7,3±0,3

n=10

8,9±0,2

n=9

8-10

8-10

7-8

мм:тчк =

1:25

8-10

7-8

8-10

8:1 мм =

1:1

7:2,5 мм =

1:1

8-10

3-4

8-10

8-10

15 суток в голодном

клеще I. ricinus

146 суток в голодном

клеще I. ricinus

18 суток в голодном

клеще I. persulcatus

48 суток в голодном

клеще I. persulcatus

14 суток в голодном

клеще D. reticulatus

40 суток в голодном

клеще D. reticulatus

128 суток в голодном

клеще D. reticulatus

128 суток в голодном и

104 часа в питающемся

D. reticulatus

128 суток в голодных и

7 суток в питающемся

D. reticulatus

135 суток в голодном

клеще D. reticulatus

2,7

2,4

2 (0,3)

3

nd

nd

т11428

т 11424

т11516

т 11526

т12718

т12546

т12732

т12736

т12704

т12579

3,2

3,2

4,1

5,3

3,2

5,4

6,3

2,7

2,4

6 (0,8)

nd

nd

3,4

5 (0,7)

nd

nd

2,4

6 (0,8)

4,2

16 (1,2)

nd

nd

nd

nd

Таблица 2. Свойства вариантов штамма ЭК-328, адаптированных к

персистентной инфекции в клещах разных видов.

Обозначения см. Таблицу 1.

Для вариантов штамма ЭК-328, адаптированных к острой инфекции в

клещах I. ricinus, D. reticulatus и D. marginatus, а также к персистентной

инфекции в D. reticulatus была определена нуклеотидная последовательность

фрагментов геномов вирусов, кодирующих белок Е (Таблица 3). Единственная

мутация в белке Е, приводящая к аминокислотной замене в позиции 84

глутаминовой кислоты на лизин, была найдена только у вариантов ВКЭ

прошедших 5-7 пассажей в клещах D. reticulatus, т.е. адаптированных к острой

18

LD50,

выраженное в

БОЕ

Вариант

вируса

тв1005

тв1011

тв1090

тв1020

тв1091

тв1098

т12546

т12704

Фенотип

бляшек

Замены в

белке E

нет

нет

нет

Glu(84)Lys

Glu(84)Lys

Glu(84)Lys

Пассажная история

2 пассажа на

D. marginatus

4 пассажа на

I. ricinus

6 пассажей на

I. ricinus

5 пассажей на

D. reticulatus

6 пассажей на

D. reticulatus

1,5:3 мм=1:4

nd

4 мм

6

10:1,5-2,5мм

=1:1,6

1,5:3 мм=1:1

8-12 мм

500

nd

nd

300

инфекции в клещах. При адаптации вируса к острой инфекции в I. ricinus

соответствующей замены выявлено не было, но изменения фенотипа в виде

снижения нейроинвазивности и появления мелкобляшечных вариантов вируса

отмечались. Это можно объяснить тем, что в популяции накапливались

мутанты со сходным фенотипом, но с мутациями в разных участках белка Е. не

выявляемые при анализе консенсусной последовательности.

Таблица 3. Анализ нуклеотидной последовательности участка генома,

соответствующего белку Е, у вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ, адаптированных

к острой и персистентной инфекции в клещах.

7 пассажей на

6:3:1 мм =

D. reticulatus

13:13:10

40 суток в голодном

D. reticulatus

128 суток в голодном и

7 суток в питающемся

D. reticulatus

8-10 мм

nd

нет

8-10 мм

nd

нет

В организме зараженного клеща ВКЭ присутствует практически во всех

органах и тканях, что может оказывать определенное воздействие на вирусную

популяцию в зависимости от места размножения вируса. В связи с этим, более

гомогенной системой для изучения динамики размножения ВКЭ является

линия клеток клещей, состоящая, в основном, из эпителиальных клеток и

гемоцитов иксодид. В наших опытах мы анализировали динамику размножения

вируса в культурах клеток клещей I. ricinus (IRE/CTVM19) и Hyalomma

anatolicum anatolicum (HAE/CTVM8), а также в культуре клеток СПЭВ. В

19

работе использовали штамм ЭК-328, а также М-вариант, полученный ранее при

адаптации штамма ЭК-328 к клещам H. marginatum marginatum и имеющий

ГАГ-связывающий фенотип.

Штамм ЭК-328 интенсивнее всего вирус размножался в клетках СПЭВ при

37°С, где прирост титров начался уже после 12 часов инкубации (Рисунок 4).

При снижении температуры содержания инфицированных клеток СПЭВ до

32°С, инкубационный период ВКЭ увеличился до 24 часов. При этом

интенсивность нарастания и максимальные значения титров остались без

изменений. Динамика накопления вируса в клетках клещей в целом сходна с

таковой для клеток СПЭВ при 32°С. К 60 часам после инфицирования во всех

культурах клеток и при разных температурных режимах титры вируса были

одинаковыми. Сходная динамика размножения вируса в культурах клеток

клещей наблюдалась и для М-варианта, однако накопление вируса в КЖ клеток

СПЭВ у него снижено (Рисунок 4). Таким образом, динамика размножения

штамма ЭК-328 ВКЭ, изначально выделенного из клещей I. persulcatus из

Эстонии, была сходной как в культуре клеток основных переносчиков ВКЭ, так

и в клетках других клещей (H. anatolicum anatolicum).

На клетках IRE/CTVM19 мы изучили долгосрочную хроническую

инфекцию, вызванную штаммом ЭК-328 и М-вариантом. Период наблюдения

составил 120 суток. Динамика размножения штамма ЭК-328 и М-варианта была

в целом сходной. Для штамма ЭК-328 наряду с обыкновенными бляшками

диаметра 8-10 мм было характерно появление ярких бляшек разных размеров

от точечных до 3-4 мм в диаметре. Для М-варианта было отмечено изменение

их фенотипа с характерных точечных до бледных бляшек с размытыми краями

диаметром 1-2 мм и 5-6 мм.

У варианта 5000ЭК, полученного при персистенции штамма ЭК-328 в

течение 120 суток в клетках IRE/CTVM19, нейроинвазивность заметно

снизилась (Таблица 3). Для данного варианта, прошедшего дополнительный

пассаж

в

клетках

IRE/CTVM19,

была

получена

нуклеотидная

последовательность всего генома (за исключением концевых участков,

20

HAE/CTVM8, 32°C

IRE/CTVM19, 28°C

А)

9

8

7

6

5

4

3

2

Б)

Рисунок 4. Динамика размножения штамма ЭК-328 (А) и М-варианта (Б) в

культуре клеток клещей Ixodes ricinus (IRE/CTVM19), Hyalomma anatolicum

anatolicum (HAE/CTVM8) и СПЭВ.

21

СПЭВ, 37°C

Время после заражения

HAE/CTVM8, 32°C

IRE/CTVM19, 28°C

СПЭВ, 32°C

СПЭВ, 37°C

расположенных под праймерами - 16 нт в 5’-НТО и 25 нт в 3’-НТО). Было

обнаружено только две нуклеотидные замены (A1172→C (белок Е); T5343→C

(белок NS3)), одна из которых находилась в белке Е и приводила к замене

аспарагиновой кислоты на аланин в позиции 67 белка Е, т.е. повышению

локального положительного заряда. Для варианта 5000М, полученного при

персистенции М-варианта в течение 120 суток, было характерно сохранение

низкой

нейроинвазивности.

Анализ

нуклеотидной

последовательности

фрагмента генома, кодирующего белок Е, данного варианта показал, что

вариант

сохранил

мутацию

в

позиции

122,

обеспечивающую

ГАГ-

связывающий фенотип, при этом произошла реверсия по позиции 426 белка Е

(изолейцин→треонин) (Таблица 3).

9

8

7

6

5

4

3

2

Время после заражения

выраженное в

(по сравнению с

БОЕ (в

исходным

скобках

штаммом ЭК-

указаны lg)

328)

Фенотип

бляшек

Вирус

Пассажная история

исходный вирус в

виде КЖ клеток

8-10 мм

50 (1,7±0,3)

-

СПЭВ

штамм

ЭК-328

штамм

120 суток + 1 пассаж

ЭК-328

в культуре клеток

(5000ЭК)

клещей I. ricinus

17 пассажей штамма

3:1 мм =

1:3

(7-8) мм:

тчк =1:100

6:3:1 мм =

1:1:4

200 (2,3)

Asp67→Ala

ЭК-328 в Hyalomma

marginatum + (2-5)

через мозг мышей

120 суток + 1 пассаж

в культуре клеток

клещей I. ricinus

Glu122Gly

Thr426Ile

Glu122Gly

М-вариант

М-вариант

(5000М)

Таблица 3. Свойства вариантов штамма ЭК-328, адаптированных к

персистентной

инфекции

в

культуре

клеток

клещей

Ixodes

ricinus

(IRE/CTVM19).

LD50/мл,

Замены в белке Е

Появление

мутантов

с

ГАГ-связывающим

фенотипом

является

эпидемиологически важным явлением, т.к. при циркуляции вируса с низкой

нейроинвазивностью риск заражения может оставаться высоким, но при этом

риск заболевания будет ниже.

Таким

образом,

в

данной

работе

были

проанализированы

паразитологические и вирусологические факторы, оказывающие влияние на

локальный риск заражения в природном очаге КЭ.

Выводы

1. Физиологическое состояние клещей (физиологический возраст) и их

зараженность

ВКЭ

являются

важными

факторами,

определяющими

поведение клещей. В экспериментах с клещами I. ricinus наиболее высокой

поисковой активностью обладают особи IV физиологического возраста и

особи,

зараженные

ВКЭ.

Вирусная

инфекция

повышает

поисковую

активность клещей и их толерантность к действию репеллента ДЭТА.

22

10000 (4)

10000 (4)

2. В период массовой активности клещей соотношение особей разного

физиологического возраста в природных популяциях различается не только в

удаленных друг от друга регионах, но и также в районах с похожими

ландшафтно-климатическими

условиями.

В

период

наблюдения

вне

зависимости

от

региона

в

большинстве

исследованных

природных

популяций преобладали клещи III физиологического возраста.

3. Впервые показано, что при достаточной влажности клещи разных видов

(Ixodes ricinus и I. persulcatus) из одного региона реагируют на запахи

растительного происхождения сходным образом, тогда как реакция клещей

одного вида (I. persulcatus) из удаленных друг от друга регионов может

значительно различаться.

4. При экспериментальной инфекции ВКЭ способен размножаться, достигать

высоких титров и развивать персистентную инфекцию в клещах разных

видов и перевиваемых культурах клеток клещей – как основных, так и

второстепенных переносчиков вируса. Уровень репродукции ВКЭ в

иксодовых

клещах

зависит

от

температуры

окружающей

среды

и

значительно повышается при питании клещей.

5. Адаптация ВКЭ к острой инфекции в основных и второстепенных клещах-

переносчиках вируса, а также к персистентной инфекции в перевиваемых

культурах клеток клещей приводит к повышению гетерогенности вирусной

популяции и селекции вариантов ВКЭ со сниженной нейроинвазивностью

для лабораторных мышей и мутациями в белке Е, повышающими локальный

положительный заряд вириона. При персистентной инфекции ВКЭ в клещах

разных видов наблюдается повышение гетерогенности популяции без

быстрого отбора подобных мутантов.

6. Впервые

в

прямом

слепом

эксперименте

при

использовании

экспериментально зараженных ВКЭ иксодовых клещей разных видов было

показано, что ПЦР в реальном времени является более чувствительным и

оптимальным методом для оценки зараженности иксодовых клещей ВКЭ,

чем ИФА.

23

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, а также в

зарубежных журналах, входящих в международные системы цитирования

1. Belova O.A. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed

versus partially engorged ixodid ticks – Evidence of virus replication and changes

in tick behavior / O.A. Belova, L.A. Burenkova, G.G. Karganova // Ticks and

Tick-borne Diseases. – 2012, Vol. 3, Issue 4. – P. 240– 246.

2. Bugmyrin S.V. Distribution of Ixodes ricinus and I. persulcatus ticks in southern

Karelia

(Russia)

/

S.V.

Bugmyrin,

L.A.

Bespyatova,

Y.S.

Korotkov,

L.A. Burenkova, O.A. Belova, L.Iu. Romanova, L.I. Kozlovskaya, G.G.

Karganova, E.P. Ieshko // Ticks and Tick-borne Diseases. – 2013. – Vol. 4, Issue

1-2. – P. 57– 62.

3. Белова О.А. Эффективность детекции вируса клещевого энцефалита в

иксодовых клещах (Acari: Ixodidae) с помощью ИФА и ПЦР в реальном

времени / О.А. Белова, Л.А. Буренкова, Л.С. Карань, Н.М. Колясникова,

Н.Г. Топычканова, И.Н. Кувшинова, Д.И. Тимофеев, М.Ю. Рукавишников,

М.П. Гришаев, Г.Г. Карганова // Вопросы вирусологии. – 2014. – №5. – С. 38-

43.

4. Холодилов И.С. Неоднозначность трактовки результатов при оценке

зараженности клещей вирусом клещевого энцефалита с использованием

различных методов исследования / И.С. Холодилов, О.А. Белова,

О.В. Мотузова, А.П. Гмыль, О.Е. Орлова, Л.Ю. Романова, В.А. Бойко, Р.А.

Крючков,

А.Ф.

Шамсутдинов,

Г.Г.

Карганова

//

Эпидемиология

и

Вакцинопрофилактика. – 2014. – № 3, Вып. 76 – С. 29-36.

5. Bugmyrin S.V. Morphological differentiation of Ixodes persulcatus and I. ricinus

hybrid larvae in experiment and under natural conditions / S.V. Bugmyrin,

O.A. Belova, E.P. Ieshko, L.A. Bespyatova, G.G. Karganova // Ticks and Tick-

borne Diseases. – 2015. - Vol. 6, Issue 2. – P. 129-132.

6. Белова О.А. Нейроинвазивность вариантов вируса клещевого энцефалита,

адаптированных к иксодовым клещам / О.А. Белова, И.С. Холодилов,

Г.Г. Карганова // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5;

URL: http://www.science-education.ru/128-21883 (дата обращения: 30.09.2015).

24

Статьи в прочих изданиях

1. Белова О.А. Сравнительный анализ эффективности различных методов

заражения иксодовых клещей вирусом клещевого энцефалита / О.А. Белова,

Л.И. Козловская, Л.Ю. Романова, А.С. Шевцова, Л.А. Буренкова //

Медицинская вирусология: труды ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. – 2008. –

Т.25. – С. 47-52

2. Буренкова Л.А. Фауна и экология иксодовых клещей – переносчиков

клещевых инфекций человека в Республике Тыва / Л.А. Буренкова, Ю.С.

Коротков, О.А. Белова, А.В. Шевцова, Л.Ю. Романова, В.В. Кудрявцев, Н.Д.

Ооржак, М.О. Мижит, С.К. Селезнева, Г.Г. Карганова // Медицинская

вирусология: труды ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. – 2008. – Т.25. – С. 59-

64.

3. Белова О.А. Клещи рода Dermacentor (Acari: Ixodidae) как возможные

переносчики вируса клещевого энцефалита / О.А. Белова, Л.А. Буренкова,

С.А. Брискер, Г.Г. Карганова // Фундаментальные и прикладные аспекты

изучения паразитических членистоногих в XXI веке: материалы междунар.

конф. (Санкт-Петербург, октябрь 2013 г.). – Санкт-Петербург, 2013. – С. 28-

30.

Благодарности

Выражаю

глубокую

благодарность

дирекции

ФГБНУ

ИПВЭ

им.

М.П. Чумакова (директору д.м.н., чл-корр. РАН, профессору М.И. Михайлову)

за предоставленную возможность выполнения данной работы. Я искренне

благодарна д.б.н., профессору Г.Г. Каргановой и к.б.н. Л.А. Буренковой за

научное

руководство,

постоянное

внимание

и

поддержку.

Благодарю

сотрудников ФГБНУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова к.б.н. Л.Ю. Романову, к.б.н.

Л.И. Козловскую, А.Г. Литова, И.С. Холодилова, Ю.В. Рогову, Р.С. Блинову,

Л.Л. Чернохаеву, В.М. Курагину, О.В. Мотузову, к.б.н. Л.В. Гмыль за помощь и

участие в настоящей работе, к.б.н. А.П. Гмыль за поддержку, ценные советы и

плодотворные научные дискуссии. Я благодарна своим официальным

оппонентам и рецензентам за внимательное прочтение работы и ценные

замечания. Я благодарна всем соавторам моих работ, не упомянутых выше, за

помощь в проведении данных исследований.

25



Похожие работы:

«Котова Полина Дмитриевна ПУРИНЕРГИЧЕСКАЯ И АДРЕНЕРГИЧЕСКАЯ СИГНАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пущино – 2015 Работа выполнена в лаборатории молекулярной физиологии клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки Российской академии наук. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесников Станислав...»

«Тищенко Светлана Викторовна ИССЛЕДОВАНИЕ РНК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В КОМПЛЕКСАХ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ С РИБОСОМНЫМИ И МАТРИЧНЫМИ РНК молекулярная биология 03.01.03 Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пущино-2015 Гарбер Мария Борисовна Никонов Станислав Владимирович Официальные оппоненты: Сергиев Пётр Владимирович доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор доктор химических наук, профессор кафедры химии...»

«КУЗЬМИНА УЛЬЯНА ШАФКАТОВНА РЕГУЛЯЦИЯ NMDA-РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2015 Доктор биологических наук Доктор медицинских наук Доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО Башкирский государственный университет, г. Уфа Доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник ФГБНУ Научный центр неврологии,...»





 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.