авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

1

На правах рукописи

Максимова Ольга Владимировна

Оценка микробиоты кишечника у детей с аллергическими

заболеваниями в зависимости от массы тела

03.02.03 – Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2015

2

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном

учреждении высшего профессионального образования Первый Московский

государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства

здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Зверев Виталий Васильевич, академик РАН, доктор биологических наук,

профессор

Научный консультант

Гервазиева Валентина Борисовна, доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ

Официальные оппоненты:

Катосова Любовь Кирилловна, доктор биологических наук, профессор, ФГБУ

«Научный центр здоровья детей» Министерства здравоохранения Российской

Федерации, главный научный сотрудник лаборатории микробиологии

Шенедеров Борис Аркадьевич, доктор медицинских наук, профессор, ФБУН

«Московский

научно-исследовательский

институт

эпидемиологии

и

микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, главный научный

сотрудник лаборатории биологии бифидобактерий

Ведущая организация:

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (г. Санкт-Петербург)

Защита состоится «____»______________2016 года в

часов на

заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБНУ НИИВС им.

И.И. Мечникова по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер. д. 5А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института и на сайте

ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова; www.instmech.ru

Автореферат разослан ________ 201__года

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

И.В. Яковлева

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Аллергические

заболевания

по-прежнему

остаются

актуальной

проблемой практического здравоохранения. Помимо роста числа аллергических

заболеваний, параллельно наблюдается увеличение в популяции числа лиц с

избыточным весом и ожирением. В настоящее время в развитых странах мира

до 25% подростков имеют избыточную массу тела, а 15% детского населения

страдает ожирением. По некоторым данным, в Российской Федерации ожирение

выявлено у 5,5% детей, проживающих в сельской местности, и у 8,5% - в

городской (Добло А.В., 2015). Отмечается существенная связь ожирения с

развитием и утяжелением аллергической патологии (Астафьева Н.Г. и др., 2014).

Несмотря на значительное внимание

научной общественности к

экологическим факторам, в том числе к особенностям питания в детском

возрасте, исследователям до сих пор не удавалось окончательно установить

определяющие факторы в формировании аллергической реактивности и

ожирения. Согласно гигиенической гипотезе, изменения в окружающей среде,

связанные с так называемым «западным образом жизни», привели к снижению

микробного контакта

в раннем возрасте и

таким

образом нарушили

формирование нормального защитного иммунитета, обусловив становление

аллергического фенотипа. Отсутствие

у ребенка достаточной стимуляции

иммунной системы слизистой оболочки кишечника может привести к срыву

формирования оральной толерантности и развитию хронического воспаления, на

фоне которого могут развиваться аллергические реакции на пищу (пищевая

аллергия/пищевая

непереносимость

с

синдромом

раздраженной

кишки),

сопровождающиеся, как правило, дисбактериозом кишечника. Во многих

клинических исследованиях было показано, что кишечная микробиота,

взаимодействуя с лимфоидной тканью, ассоциированной с кишечником,

обеспечивает первую линию защиты организма хозяина (Bischoff S.C., Krämer S.,

2007; Azad M.B., 2012).

4

В то же время в эксперименте на мышах было установлено, что

микроорганизмы кишечника участвуют в энергетическом обмене, поддержании

контроля

массы тела и ожирении (Santacruz A. et al., 2009). Дисбаланс

микробиоты кишечника приводит к развитию резистентности к инсулину и

формированию хронического воспаления (Cani P.D. et al., 2007; 2008). Таким

образом, ранние манипуляции с микробными сообществами кишечника могут

предложить

новую

стратегию

по

предотвращению

аллергической

сенсибилизации и накоплению избыточной массы тела.

Степень разработанности темы исследования

В последнее время

представление о роли микробиоты человека, ее

многообразии, о выполняемых ею функциях и участии в патогенезе различных

инфекционных и неинфекционных заболеваний значительно расширилось. На

сегодняшний день все больше различных заболеваний связывают с нарушениями

состава и функционирования микробиоты кишечника. Согласно современной

классификации микроорганизмов, отраженной во 2-ом издании (2001 г.)

руководства Берджи, бактерии делят на два домена: Bacteria и Archaea. В домен

Bacteria входят 22 типа, из которых медицинское значение имеют следующие:

Тип ВIV Deinococcus-Thermus, Тип В XII Proteobacteria, Тип В XIII Firmicutes,

Тип В XIV Actinobacteria, Тип В XVI Chlamydiae, Тип В XX Bacteroidetes.

Используя молекулярно – генетические методы исследования, P.B.Eckburg и

соавтр.

(Eckburg

P.B.

et

al.,

2005)

установили, что

доминирующими

микроорганизмами в кишечнике человека, составляющими более 90% всех

бактерий, являются представители типа Bacteroidetes (Bacteroides) и Firmicutes

(Bacillus, Streptococcus , Staphylococcus, Clostridium, Lactobacillus, Enterococcus,

Peptococcaceae,

Peptostreptococcus и др.) (Воробьев А. А. и др., 2003;

http://www.booksmed.com/).

Анализ литературы свидетельствует о том, что микробиота кишечника

активно исследуется при таких заболеваниях, как воспалительные заболевания

кишечника (Gevers D. et al., 2014; Salonen A., Palva A., 2010; Kamada N. et al.

2013), целиакия (Olivares M. et al., 2014), сахарный диабет 2 типа (Larsen N.

5

et al., 2012; Karlsson F.H. et al., 2013), аллергические заболевания (Prince B.T.

et al., 2015), в частности, бронхиальная астма (Huang Y.J. et al., 2015),

заболевания сердечно – сосудистой (Aqel B., DiBaise J.K., 2015; Nagatomo Y.,

Tang W.H., 2015) и нервной системы (Hsiao E.Y. et al., 2013).

Кроме того, существует ряд работ, посвященных изучению взаимосвязи

между микробиотой кишечника и ожирением (Ley R.E. et al., 2006; Santacruz A.

et al., 2009; Ridaura V.K. et al., 2013; Kong L.C. et al., 2013). Большинство из них

было выполнено на животных моделях. Исследования микробиоты кишечника у

людей были единичными, проводились у взрослых пациентов и оказались не

однозначными. В некоторых исследованиях было показано, что у пациентов с

ожирением численность Bacteroidetes снижена, а Firmicutes повышена (Ley R.E.

et al., 2005; 2006; Turnbaugh P.J. et al., 2006). В то же время получены и

противоположные результаты, согласно которым у пациентов с избыточным

весом и ожирением численность Bacteroidetes была повышена, а Firmicutes

снижена (Schwiertz A. et al., 2010). В других работах разницы в соотношении

Firmicutes/Bacteroidetes у тучных и худых пациентов не обнаруживали

(Duncan S.H. et al., 2008; Jumpertz R. et al., 2011).

Следует отметить, что практически не был изучен количественный и

качественный состав микробиоты кишечника у здоровых детей в зависимости от

их массы тела. В этой связи изучение микробиоты кишечника у детей разных

возрастных групп и с различной массой тела, с наличием аллергических

заболеваний и сопутствующей патологии, представляет особый интерес.

Цель исследования:

Выявить особенности микробиоты кишечника у детей с аллергическими

заболеваниями и оценить взаимосвязь с наличием ожирения.

Задачи исследования:

1.

Сформировать группы детей в возрасте от 2 до 17 лет с различной

массой тела, страдающих аллергическими заболеваниями и условно здоровых

(группа сравнения), и дать им клинико – иммунологическую характеристику.

6

2.

Исследовать

структуру

микробиоты

кишечника

у

детей

сформированных групп с различной массой тела.

3.

Определить количественные и качественные различия родового

состава микробиоты кишечника у детей исследуемых групп с учетом

особенностей анамнеза и массы тела.

4.

Сравнить

показатели

микробиоценоза

кишечника

детей

с

аллергическими заболеваниями в зависимости от массы тела.

Научная новизна исследования.

Впервые изучена и охарактеризована микробиота детей и подростков с

аллергическими заболеваниями в зависимости от массы тела. Выявлены

качественные и количественные различия облигатной и факультативной

микробиоты кишечника у детей с аллергическими заболеваниями и различной

массой тела с учетом способа вскармливания и родоразрешения, в сравнении с

условно здоровыми детьми.

Аллергическая

патология

и

ожирение

по-разному

связаны

с

численностью облигатной и факультативной микробиоты кишечника детей. Так,

впервые показано, что численность Bacteroidetes у детей с аллергическими

заболеваниями во всех весовых категориях снижена, в отличие от условно

здоровых детей, у которых число этих микроорганизмов снижено только при

ожирении. При этом бронхиальная астма и аллергический риноконъюктивит

ассоциированы со снижением численности Bacteroidetes по мере увеличения

массы тела.

Количество анаэробных кокков также снижалось с увеличением массы

тела у всех детей с аллергией, независимо от ее клинических проявлений. В то

же время аллергические заболевания ассоциированы с выявлением Bacillus spр. в

микробиоте кишечника вне зависимости от массы тела детей.

Впервые установлено увеличение высеваемости Clostridium spр. у детей

с повышением массы тела независимо от наличия аллергии.

Таким образом, полученные на основе культуральных методов данные

исследования микробиоты кишечника детей с различной массой тела и

7

проанализированные с учетом современной классификации микроорганизмов,

позволили заключить, что наличие аллергии не влияло на соотношение

Firmicutes/Bacteroidetes. В то же время обнаружена

четкая взаимосвязь

соотношения этих микроорганизмов с увеличением массы тела у здоровых

детей, а именно, с набором веса количество Firmicutes увеличивалось за счет

Clostridium spp., а численность Bacteroidetes снижалась.

Теоретическая и практическая значимость

Выявленные

качественные и количественные изменения в составе

облигатной и факультативной микробиоты кишечника у детей с аллергическими

заболеваниями отражают нарушение микробиоценоза слизистой оболочки и

могут способствовать развитию воспалительного процесса в ЖКТ, особенно у

детей с ожирением. В пользу этого суждения свидетельствует установленное

нами значимое увеличение биомаркеров воспаления (лептин, СРБ и ФНО-α) у

этих детей. В этой связи оценка микробиоты кишечника и ее результаты могут

быть использованы как критерии субклинического воспаления в кишечнике при

увеличении массы тела в динамике развития детей. Выявленные изменения в

микробиоте

позволят

обеспечить

подбор

оптимальных

пробиотических

препаратов с целью ее коррекции.

Поскольку выявленные показатели количественного состава облигатной и

факультативной микробиоты у условно здоровых детей с различной массой тела

отличались от используемых в практике стандартов, следует рекомендовать в

клинической практике обращать внимание на массу тела исследуемого пациента

при оценке дисбактериоза кишечника.

Полученные результаты внедрены и используются в цикле лекций

кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии ГБОУ ВПО Первый

МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России и в практике гастроэнтерологов

диагностического центра ДГП №48 г. Москвы.

8

Методология и методы исследования.

Методологической

основой

исследования

послужили

работы

отечественных и зарубежных учёных в области медицинской микробиологии и

иммунологии. В работе использованы микробиологические, иммунологические

методы, а также методы статистической обработки полученных результатов.

Диагноз, степень тяжести и фазу аллергических заболеваний устанавливали по

совокупности

всех

клинических

признаков,

данных

лабораторно-

инструментального обследования больных в клинике и диагностических

центрах.

Критерии включения в исследование: наличие аллергического

заболевания, подтвержденного аллергологическими методами обследования.

Критерии исключения из исследования: наличие заболеваний, требующих

приема

антибактериальных,

слабительных

препаратов,

пробиотиков;

заболевания и состояния, сопровождающиеся декомпенсацией жизненно-важных

функций организма. Исследование было одобрено Локальным этическим

Комитетом ФГБНУ НИИВС им. И. И. Мечникова, получено информированное

согласие от родителей детей на участие в исследовании.

Предметом исследования служили 106 образцов фекалий и 55 образцов

сывороток крови детей в возрасте от 2 до 17 лет.

Сбор данных анамнеза и жалоб, данные физикального исследования,

клинического и биохимического анализов крови, данные УЗИ органов брюшной

полости получали из медицинских карт.

Весовые

категории

(нормальный,

избыточный

вес

и

ожирение)

определяли по перцентилям (Р) вариационного ряда с учётом возраста, пола и

индекса массы тела (ИМТ) в соответствии с рекомендациями ВОЗ.

Выделение

и

идентификацию

микроорганизмов

проводили

по

общепринятым методикам на основании морфологических, культуральных и

биохимических свойств (Никитин В.М., 1986; Коршунов В.М., 1997), а

интерпретацию полученных результатов проводили на основе «Протокола

ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003).

9

Для выделения аэробной и анаэробной микробиоты кишечника посевы

производили на следующие среды: бифидум среда, лактобакагар, среда Левина,

среда №10 ГРМ, желточно-солевой агар, среда Эндо, среда Клиглера, среда

Симмонса, энтерококкагар, кровяной агар, среда Вильсона – Блера, кровяной

анаэробный бактоагар с канамицином и желчью (производитель г. Оболенск,

Россия), Sabouraud Dextrose Agar (Serva, США).

Посевы культивировали в аэробных, микроаэрофильных и анаэробных

условиях с использованием микроанаэростата и газогенераторных пакетов

Compact/W-ZIP (БиоВитрум) в течение 24-72 часов при температуре 37°С.

Биохимическую идентификацию проводили с помощью диагностических тест-

систем: API® 20 E, API® 20 C AUX, API® 20 Staph; API® 20 Strept, API® 50 CH,

API® 20A (bio Mérieux, Франция).

Количество микроорганизмов каждого рода в 1 г клинического образца

устанавливали

по

числу

колоний,

выросших

на

дифференциально-

диагностических питательных средах с пересчетом на единицу посевного

материала и степени его разведения.

Идентификацию чистых культур проводили по морфологическим,

тинкториальным,

культуральным

и

биохимическим

свойствам

согласно

Справочнику Берджи по систематике бактерий (Bergey's Manual of Systematic

Bacteriology, 1997).

Количество микроорганизмов каждого вида в грамме исследуемого

материала подсчитывали по формуле:K=E*10 n+1, где

K – количество микроорганизмов,

E – количество выросших колоний в данном разведении,

n – степень разведения.

Данные

количественного

микробиологического

анализа

были

представлены в lg числа колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г исследуемого

материала (КОЕ/г).

Определение общего IgE, содержания sIgE к пыльцевым, пищевым,

бактериальным, бытовым и эпидермальным аллергенам, С-реактивного белка

10

(СРБ), провоспалительных интерлейкинов ФНО-ά и ИЛ-6 в сыворотке крови

проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) при

помощи коммерческих наборов реагентов производства «Вектор-Бест» (г.

Новосибирск, Россия) в соответствии с Инструкциями по применению.

Определение количественного содержания лептина проводили методом ИФА с

помощью набора реагентов производства «DRG Instruments» (г. Марбург,

Германия) в соответствии с Инструкцией по применению. Измерение

оптических плотностей исследуемых образцов производили с помощью

спектрофотометра ThermoFisher (г. Вантаа, Финляндия) в двух волновом

режиме: основной фильтр 450 нм, референс – фильтр в диапазоне 620 – 655 нм.

Статистическую обработку материала проводили с использованием

пакета прикладных программ «Statistica 7.0». Выборки данных проверяли на

нормальность

распределения

(критерий

Колмогорова-Смирнова).

Для

количественных показателей рассчитывали среднюю арифметическую величину

(m) и стандартное отклонение (SD). В случае отсутствия нормального

распределения для описания результатов рассчитывали медиану (Ме) и

интерквартильный размах (25 и 75 перцентили) (Гланц С., 1999). При

необходимости проводили аппроксимацию единичных числовых показателей

при помощи десятичного или натурального логарифмирования. Проверку

равенства средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия

Стьюдента при соответствии нормальному закону распределения признака в

исследуемых выборках, и использовали непараметрический критерий Манна-

Уитни (U-тест) для оценки статистической значимости различий показателей

выборок, не подчиняющихся закону нормального распределения. Различия

между показателями считали статистически значимыми при р0,05. С целью

обнаружения

связи

между

исследуемыми

показателями

проводили

корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции

Спирмена (R). При корреляционном анализе связь между показателями

оценивали как сильную при абсолютном значении коэффициента корреляции

Спирмена R0,70, имеющую среднюю силу при R от 0,69 до 0,30 и как слабую

11

при R0,29; при р0,05 (Гржибовский А.М., 2008). Сравнение частот и долей

проводили с помощью критерия хи-квадрат (χ2) Пирсона, вычисляли отношение

шансов (OШ) с 95%-ным доверительным интервалом (ДИ).

Личное участие автора в получении результатов

Автором составлен план работы, проведен аналитический анализ

отечественной и зарубежной литературы. Самостоятельно выполнены все

основные разделы работы, сбор клинического анамнеза из карт пациентов,

анкетирование родителей, проведено исследование

нормальной микробиоты,

выделение

бактерий

в

смешанных

микробных

сообществах,

их

бактериологическое, микроскопическое, биохимическое исследование.

Консультации и помощь в выборе пациентов осуществлены совместно с

заведующей детским аллергологическим отделением ФГБНУ НИИ питания,

д.м.н., проф. В.А. Ревякиной, детскими гастроэнтерологами ДГП № 148 ЮВАО

А.М. Нерсесян и ДГП № 48 ЮВАО Д.В. Овсянниковым. Микробиологические

исследования проводили в лаборатории клинической микробиологии ФГБНУ

НИИВС

им.

И.И.Мечникова

(зав.

лабораторией

к.м.н.

Зайцева

Е.В.).

Иммунологические исследования сывороток детей проводили в лаборатории

аллергодиагностики ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова совместно с ведущим

научным сотрудником к.б.н. С.А. Мазуриной (зав. лабораторией проф., д.м.н.

В.Б.Гервазиева).

Положения, выносимые на защиту

1.

Аллергическая патология и ожирение по-разному взаимосвязаны

с изменениями численности облигатной и факультативной микробиоты

кишечника детей. Аллергические заболевания у детей ассоциированы с

пониженной численностью Bacteroidetes spp. и наличием Bacillus spр. во

всех весовых категориях, а также со снижением численности анаэробных

кокков по мере увеличения массы тела. Ожирение, в свою очередь,

характеризуется снижением Bacteroidetes spp., в особенности у здоровых

детей, и увеличением численности Clostridium spр., независимо от наличия

аллергии. У детей с аллергическими заболеваниями изменяется родовой

12

состав Firmicutes, что в целом не влияет на их соотношение с Bacteroidetes.

У здоровых детей

по мере повышения массы тела соотношение

численности Firmicutes/Bacteroidetes увеличивается.

2.

Снижение

численности

Bacteroidetes,

анаэробных

кокков

и

энтерококков у детей ассоциировано с бронхиальной астмой и аллергическим

ринитом, а численность Clostridium прямо коррелировала с увеличением массы

тела детей. При атопическом дерматите только численность анаэробных кокков

обратно коррелировала с массой тела.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

О достоверности полученных результатов свидетельствует использование

сертифицированных

реагентов

и

современных

бактериологических,

биохимических и иммунологических методов исследования. Достоверность

полученных результатов подтверждена статистическими методами.

Диссертация апробирована на конференции кафедры микробиологии,

вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Минздрава России, протокол № 10 от 28 августа 2015 года.

Результаты исследования были доложены на

конференции молодых

ученых ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова (г. Москва, 23 апреля 2014 г.),

совместной конференции молодых ученых ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова

и ФГБНУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова, посвященной 170-летию И.И. Мечникова

(г. Москва, 15-16 апреля 2015 г.) и на XV Всероссийском научном форуме с

международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в

Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 1-4 июня 2015).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 9 научных публикациях: 4

статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, в зарубежном журнале – 1, в

других изданиях – 4.

13

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, основного текста (обзор литературы и главы

собственных

исследований),

заключения,

списка

сокращений,

списка

литературы. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста,

иллюстрирована 10 рисунками, 2 таблицами. Библиографический указатель

включает 168 наименований, из них 28 отечественных и 140 зарубежных

источников литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Клинико – иммунологическая характеристика детей

В исследование включено 106 детей обоего пола в возрасте от 2 до 17

лет. Все дети были распределены по весовым категориям: с нормальной массой

тела было 38 детей (20 мальчиков и 18 девочек), с избыточной – 14 детей (10

мальчиков и 4 девочки) и с ожирением – 54 ребенка (26 мальчиков и 28 девочек).

Распределение детей согласно их массе тела и возрасту (Рис.1) показало, что

доля детей с ожирением превалировала в подростковом периоде в возрасте 10 –

17 лет (ОШ = 16,76; 95 %, ДИ: 5,98–46,94; p 0,0001). Взаимосвязи между

ожирением и полом у детей не выявлено.

%

Рис. 1. Распределение детей по весу в зависимости от возраста.

Группа с аллергическими заболеваниями включала в себя 58 детей (33

мальчика и 25 девочек), а в группу сравнения вошло 48 условно здоровых детей

(23 мальчика и 25 девочек).

14

Аллергические заболевания были представлены атопическим дерматитом

у 31 (53%) ребенка, у 15 (26%) - аллергическим ринитом и 12 (21%) детей были с

бронхиальной астмой. Атопический дерматит у 5 (17%)

детей сочетался с

аллергическим риноконъюктивитом и у 7 (23%) детей с пищевой аллергией.

Бронхиальная

астма

у

7

(58%)

детей

сочеталась

с

аллергическим

риноконъюктивитом. У всех детей выявлялась сенсибилизация к пыльцевым,

пищевым, бытовым и эпидермальным аллергенам. Уровень общего IgE в

сыворотке крови был повышен в 31% случаев и составил у детей до 10 лет

17,5(8,7;98) МЕ/мл и после 10 лет 70(15,7;235) МЕ/мл.

Мы также проанализировали распределение детей с различными

аллергическими заболеваниями в зависимости от массы тела (Рис. 2).

Рис. 2. Распределение аллергических заболеваний у детей с различной массой

тела.

Как видно из Рис. 2, доля детей с бронхиальной астмой по мере нарастания

массы тела увеличивалась (ОШ = 4,26; 95% ДИ: 1,018 - 17,86; p = 0,047). А у

Группы детей с различной массой тела

Нормальная

Избыточная

Ожирение

Маркеры воспаления

Лептин,

Аллергия

15

детей с атопическим дерматитом чаще отмечался нормальный и избыточный

вес (ОШ = 4,20; 95% ДИ: 1,40 - 12,60; p=0,0105). У детей с аллергическими

заболеваниями в 3,87 раза чаще встречалась отягощённая наследственность по

атопии в отличие от условно здоровых детей. Мы не выявили связи между

тяжестью течения аллергического заболевания и массой тела. Также не

обнаружено взаимосвязи между способом рождения и набором веса среди всех

детей, включенных в исследование. В то же время среди детей с ожирением и

аллергией чаще встречались дети, находившиеся на искусственном и смешанном

вскармливании (ОШ= 4,50; 95% ДИ: 1,29 - 15,68; p =0,0182), в отличие от всех

обследуемых детей (ОШ= 2,64; 95 % ДИ: 1,11 – 6,26; p = 0,0277). Это говорит о

том, что дети с искусственным или смешанным вскармливанием в анамнезе

имеют в 1,7 раза больше шансов приобрести ожирение в будущем.

Среди всех условно здоровых детей (48 человек) с нормальной массой

тела было 8 человек (2 мальчика и 6 девочек), с избыточным весом - 6 человек

(4 мальчика и 2 девочки) и с ожирением - 34 ребенка (17 мальчиков и 17

девочек). Нарушения ферментативной функции и нарушения эндокринной

системы были ассоциированы с лишним весом как у детей с аллергической

патологией, так и без нее.

Таблица 1. Лептин и маркеры воспаления у всех исследуемых детей.

17,6 [1,2; 28]*

24,39[7,07; 41,7]

5,71 [0,35; 7,6]*

4,26 [0,47; 8,06]

4,53 [3,5; 7,21]*

4,98 [3,02; 6,94]

0 [0; 2,00]

0 [0; 2,00]

44,9 [33,2; 70,9]*

59,09 [25,45; 101]

4,78 [0,6; 9]*

9,61 [4,15; 10,00]

0 [0; 0,94]

6,47 [0; 5,55]

0 [0; 20]

0 [0; 12,40]

3,06 [1,07; 7,4]

10,85[3,59; 18,1]

0,55 [0,19; 2,5]

2,45 [0,43; 4,47]

0,075 [0; 2,99]

0 [0; 0]

0 [0; 21]

6,71 [0; 7,13]

нг/мл

СРБ, мг/л

ФНО-α,

пг/мл

Без аллергии

Аллергия

Без аллергии

Аллергия

Без аллергии

ИЛ-6,

Аллергия

пг/мл

Без аллергии

*p 0,05

16

Определение маркеров воспаления показало, что уровни ФНО-α

повышены у детей с аллергией при избыточном весе (p= 0,0278), СРБ - при

избыточном весе и ожирении (p= 0, 0196, p= 0,0090), а уровень лептина был

повышен при избыточном весе и ожирении (p=0, 009, p 0,0001) у детей с

аллергией (Табл.1). Кроме того, уровень СРБ коррелировал с содержанием

лептина (r=0,27, p= 0,0473), а уровень ФНО-α - с уровнем общего IgE (r= 0,30, p=

0,0253).

Полученные результаты свидетельствуют о формировании системного

хронического воспаления по мере увеличения массы тела, более выраженном у

детей с аллергическими заболеваниями.

Поскольку известно, что ожирение

характеризуется наличием субклинического хронического воспаления, первично

возникающего в ЖКТ, можно полагать, что изменения в микробиоте кишечника

могут служить пусковым механизмом в развитии и поддержании этого процесса.

Микробиоценоз кишечника у детей с различной массой тела.

Исследование облигатной микробиоты кишечника.

Колонизация кишечника у детей начинается сразу после рождения, и к 2,5

годам микробиота детей полностью повторяет по составу таковую взрослых,

состоящую на 90% из облигатной, на 9,5% – факультативной и на 0,5% из

транзиторной микробиоты (O’Toole P.W., Claesson M.J., 2010; Fouhy F. et al.,

2012). Облигатная микробиота составляет основу микробиоценоза ЖКТ и

представлена преимущественно анаэробными сахаролитическими бактериями.

При анализе численности Bifidobacterium spp. не выявлено достоверных

количественных различий этих микроорганизмов как у детей с аллергическими

заболеваниями (Табл. 3), так и без них, но отмечена тенденция к снижению их

количества с увеличением массы тела у детей с аллергией. У здоровых детей

численность бифидобактерий обратно коррелировала с ИМТ (R = – 0,30, р =

0,0392).

У детей с аллергией и ожирением, получавших в анамнезе молочные

смеси вместо грудного молока, их численность была снижена (R = 0,65; p=

0,0019). Также обращает на себя внимание то, что численность Bifidobacterium

6,77±1,17

6,13±1,25

6,32±1,75

Высеваемость, %

17

spp. у всех детей была снижена по сравнению с возрастными нормами в

отраслевом стандарте.

Таблица 2. Состав облигатной и факультативной микробиоты кишечника у

детей с аллергическими заболеваниями и различной массой тела.

Микроорганизмы

кишечника

Bifidobacterium spp.

Bacteroides spp.

Лактобактерии

Анаэробные кокки

E.coli

Enterococcus spp.

Высеваемость, Lg КОЕ/г±σ

Нормальная

Избыточная

Ожирение,

масса, (n=30)

масса, (n=8)

(n=20)

7,25±0,82

7,25±0,89

7,09±0,70

Нормативы,

Lg КОЕ/г

9-10

7-11

6-8

8-9

7-8

5-8

6,89±0,95

6,06±0,40**

6,76±0,75

5,05±1,24

5,06±1,00

4,99±0,91

7,07±0,66

6,44±0,61**

6,54±0,65**

73%

60%

53%

23%

27%

23%

23%

62,5%

87,5%

62,5%

57%

95%**

43%

Clostridium spp.

до 4

Staphylococcus spp.

до 4

0

25%

5%

0

24%

12,5%

14%

50%

33%

S. aureus

Грибы

до 4

0

до 3

*Другие

Enterobacteriaceae

Bacillus spp.

* Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp. ** p˂0,05

Численность лактробактерий у всех детей была снижена на порядок, по

сравнению с нормативными показателями, и не зависела от массы тела.

Уровень высеваемых

Bacteroides spp. у детей с аллергическими

заболеваниями (Табл.2) был снижен во всех весовых группах. Наиболее низких

значений численность бактероидов достигала у этих детей с избыточным весом

(р = 0,00217). У всех детей без аллергической патологии (Табл.3) выявлено

достоверное снижение численности бактероидов с увеличением массы тела

(p=0,00879). При этом у детей

без аллергии с избыточной массой тела

численность Bacteroides spp. коррелировала с осложненными родами и родами с

помощью кесарева сечения в анамнезе (R = 0,87;p= 0,0255).

18

Таблица 3.

Состав облигатной и факультативной микробиоты кишечника у

условно здоровых детей с различной массой тела.

Микроорганизмы

кишечника

Bifidobacterium

spp.

Bacteroides spp.

Лактобактерии

Анаэробные кокки

E.coli

Enterococcus spp.

Clostridium spp.

Staphylococcus spp.

Высеваемость, Lg КОЕ/г±σ

Нормальная

Избыточная

Ожирение,

масса, (n=8)

масса, (n=6)

(n=34)

Нормативы,

Lg КОЕ/г

9-10

7,47±0,83

7,00±0,89

7-11

7,05±1,06

7,17±0,75

6,81±0,84

6,55±0,82**

6-8

8-9

7-8

5-8

до 4

до 4

4,69±1,09

4,79±0,82

4,74±0,83

7,00±0,76

6,34±0,92

37,5%

62,5%

62,5%

6,67±0,52

6,67±0,76

6,50±0,84

6,33±1,01

Высеваемость, %

33%

39%

100%**

97%**

83%

48%

Грибы

*Другие

Enterobacteriaceae

Bacillus spp.

S. aureus

0

0

0

6%

17%

21%

33%

21%

0

0

до 4

12,5%

0

0

до 3

0

* Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp. ** p˂0,05

У всех детей численность E.coli была в норме. У детей с аллергическими

заболеваниями и избыточным весом число кишечных палочек обратно

коррелировало с осложнением родов и рождением с помощью кесарева сечения

(R=-0,73; p= 0,0403).

Стоит отметить, что у всех детей без аллергии высевалось сниженное

количество энтерококков, не зависящее от массы тела (Табл.3). У детей с

аллергическими

заболеваниями

и нормальным весом

тела

энтерококки

высевались в 73% случаев, при избыточном весе – в 62,5% случаев и при

ожирении – 57% случаев, тогда как у детей без аллергии с нормальным весом -

в 37,5% случаев, с избыточным весом – в 33% случаев и с ожирением – в 39%

случаев. У детей с аллергией отмечалась тенденция к снижению числа

высеваемых колоний с увеличением массы тела, при этом у детей с аллергией и

19

избыточной массой тела численность энтерококков обратно коррелировала с

осложнением родов и с рождением с помощью кесарева сечения (R= -0,74;

p= 0,035).

У всех детей численность анаэробных кокков находилась в пределах

нормы. У детей с аллергическими заболеваниями по мере увеличения массы тела

их численность снижалась (p=0,0183; p=0,0155), а у детей без аллергии она не

изменялась.

Обращает на себя внимание, что облигатная микробиота кишечника у

детей с различной массой тела и определенной аллергической патологией

изменялась по – разному.

Так, у детей с атопическим дерматитом

(Рис. 3) только численность

анаэробных кокков обратно коррелировала с массой тела (R= -0,40, p= 0,025). У

детей с бронхиальной астмой обратную связь с ИМТ имела численность

бактероидов (R= -0,41, p= 0,035), анаэробных кокков (R= -0,39, p=0,042) и

энтерококков (R= -0,43, p= 0,026).

Рис.

3.

Облигатная

микробиота

кишечника

у

детей

с

различными

аллергическими заболеваниями в зависимости от массы тела.

0,0003). У детей группы сравнения

ожирением в 6% случаев.

20

Исследование

факультативной

и

транзиторной

микробиоты

кишечника

Факультативная микробиота составляет меньшую часть постоянных

обитателей биотопа и является условно-патогенной, максимальная концентрация

ее отдельных представителей не превышает 1О3-1О5 КОЕ/г.

У всех детей с увеличением веса достоверно увеличивалась численность

высеваемых Clostridium spp. Такая зависимость прослеживалась как у детей с

аллергией (p= 0,0014), так и условно здоровых детей (p=0,042, p=0,0005), в то

время как численность других бактерий не зависела от массы тела.

Численность высеваемых стафилококков у детей с аллергией и

нормальной массой тела составила 53%, с избыточной массой тела - 62,5% и

ожирением – 43%. Такая же тенденция выявлена и у здоровых детей: в группе с

нормальным весом их высеваемость составила – 62,5%, с избыточным весом –

83% и с ожирением - 48%. Следует отметить, что S.aureus высевался у детей с

аллергическими заболеваниями и нормальным весом в 23% случаев, с

избыточным весом - в 25% случаев, а с ожирением – в 5% случаев. У детей с

аллергией и нормальной массой тела численность золотистого стафилококка

коррелировала с искусственным и смешанным вскармливанием (R = 0,62; p=

S.aureus

высевался только у детей с

Обращает на себя внимание обнаружение бактерий, относящихся к роду

Bacillus spp., у детей с аллергическими заболеваниями.

При этом у детей с

нормальным весом они высевались в 23%, с избыточным весом – в 50% и с

ожирением – в 33% случаях. Кроме того, у детей с избыточной массой тела

численность Bacillus

spp. коррелировала со смешанным и искусственным

вскармливанием (R = 0,62; p= 0,013).

Микроорганизмы

семейства

Enterobacteriaceae

(Enterobacter

spp.,

Klebsiella spp., Serratia spp., Citrobacter spp.) и грибы (Candida spp., Aspergllus

spp., Rodotorula spp.) высевались в небольшом количестве у всех детей,

независимо от наличия аллергии или ожирения. У детей с аллергией и

21

нормальной массой тела численность Klebsiella spp. коррелировала со

смешанным и искусственным вскармливанием (R = 0,38; p= 0,0409).

Рис. 4. Факультативная микробиота кишечника у детей с аллергическими

заболеваниями и различной массой тела.

Кроме того, стоит отметить, что факультативная микробиота кишечника у

детей с различной массой тела и определенной аллергической патологией

(Рис. 4) по-разному изменялась. Так, у детей с бронхиальной астмой численность

Clostridium spp.

0,013).

коррелировала с увеличением

их массы тела (R= 0,47, p=

Изучение соотношения Firmicutes/ Bacteroidetes у детей с различной

массой тела

Согласно

современной

научной

классификации,

основанной

на

молекулярно-генетических методах, состав микробиоты кишечника представлен

3 типами Firmicutes, Bacteroidetes и Actinobacteria, при этом доминирующими в

кишечнике являются представители

Firmicutes

и Bacteroidetes. Анализ

соотношения Firmicutes/Bacteroidetes показал, что у детей с аллергией (Рис. 5) и

нормальной массой тела оно составило 3,52, у детей с избыточной массой тела –

4,23, а с ожирением – 3,42.

22

Рис. 5. Соотношение Firmicutes/ Bacteroidetes

у детей с аллергией и

разной массой тела.

У детей условно здоровых с нормальной массой тела (Рис.6) соотношение

Firmicutes/ Bacteroidetes составило 2,70, с избыточной массой тела – 3,06, с

ожирением – 3,18. Кроме того, у детей условно здоровых с ожирением

численность Firmicutes коррелировала с численностью Bacteroidetes (R=0,45,

p=0,0081).

Рис. 6. Соотношение Firmicutes/ Bacteroidetes у детей условно здоровых с

разной массой тела.

Оказалось, что у детей с аллергией и ожирением численность Firmicutes

увеличивалась за счет численности Clostridium spp. (p=0,0014). Такая же

тенденция прослеживалась у детей условно здоровых с избыточной массой тела,

23

ожирением (p= 0,042, p= 0,0005). В эксперименте на мышах было показано, что

Clostridium кластера XIV способствуют развитию ожирения, поддерживая

неспецефическое воспаление в жировой ткани за счет белка жгутиков –

флагеллина, который связывается с TLR-5, экспрессированными на поверхности

клеток слизистой (Pekkala S. Et al., 2015). В нашем исследовании о наличии этого

воспаления свидетельствует высокий уровень лептина и СРБ в сыворотке крови

детей с ожирением, которое, вероятно, поддерживается за счет повышения

количества Clostridium spp.

Полученные результаты показали, что наличие аллергической патологии

у детей с различной массой тела не влияло на соотношение Firmicutes и

Bacteroidetes в микробиоте кишечника. Микроорганизмы типа Firmicutes более

чем в 3 раза преобладали над типом Bacteroidetes как у детей с нормальной, так и

с избыточной массой тела и ожирением. Более того, у этих детей численность

Bacteroidetes была значительно снижена. У условно здоровых детей отмечалась

четкая взаимосвязь соотношения Firmicutes/Bacteroidetes с массой тела, причем

численность Bacteroidetes была снижена только при ожирении. Преобладание

Firmicutes происходило за счет увеличения численности представителей класса

Clostridium spp.

Таким образом, выявленные качественные и количественные изменения

облигатной и факультативной микробиоты кишечника у детей с аллергическими

заболеваниями и различной массой тела могут свидетельствовать о роли

микроорганизмов в этиологии и патогенезе этих заболеваний, ключевым звеном

которых является хроническое системное воспаление.

Выводы

1.

Клинико-иммунологическое

исследование

106

детей

с

аллергическими

заболеваниями

и

условно

здоровых

детей

выявило

преобладание избыточной массы тела и ожирения, независимо от пола, в

подростковом возрасте (10-17 лет), сопровождающееся патологией со стороны

эндокринной системы и дисфункцией органов

ЖКТ, на фоне повышенного

уровня лептина и СРБ.

24

2.

У детей с аллергическими заболеваниями ожирение ассоциировано с

бронхиальной астмой (p = 0,047), тогда как у детей с атопическим дерматитом

преобладал нормальный или избыточный вес (p =0,0105).

3.

У всех детей с ожирением вероятность выявления в анамнезе

искусственного или смешанного вскармливания была в 2,64 раза выше, а у

детей с аллергическими заболеваниями -

в 4,5 раза больше, при этом

взаимосвязи между способом рождения ребенка и набором веса не обнаружено.

4.

Содержание лактобактерий и бифидобактерий в микробиоте всех

исследованных детей была снижена независимо от массы тела и наличия

аллергии, особенно у детей со смешанным вскармливанием в анамнезе (R = 0,65;

p= 0,0019).

5.

Высеваемость бактероидов у детей с аллергическими заболеваниями

была изначально ниже во всех весовых категориях (p=0,0217), особенно у детей

с атопическим дерматитом, тогда как у детей условно здоровых она

уменьшалась по мере увеличения массы тела (p= 0,0216).

6.

У всех детей, независимо от массы тела и наличия аллергии,

выявлено сниженное количество высеваемых энтерококков на фоне неизменного

содержания кишечной палочки. Установлена обратная связь численности этих

бактерий с наличием в анамнезе осложненных родов и рождения с помощью

кесарева сечения (R= -0,74; p= 0,035; R=-0,73; p= 0,0403, соответственно).

7.

У всех детей с увеличением массы тела увеличивалась высеваемость

Clostridium spp. (p= 0,0014), в то время как численность других бактерий

факультативной флоры (стафилококки, Bacillus spp., Enterobacteriaceae и грибы)

не зависела от массы тела.

8.

S. aureus и Bacillus spp. выявлялись только у детей с аллергическими

заболеваниями и коррелировали с искусственным и смешанным вскармливанием

(R = 0,62; p= 0,0003 и R = 0,62; p= 0,013 соответственно), в то же время

численность анаэробных кокков у этих детей снижалась по мере увеличения

массы тела (p=0,0183; p=0,0155).

25

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.

Максимова, О.В. Микробиота кишечника и аллергические заболевания / О.В.

Максимова,

В.Б.

Гервазиева,

В.В.

Зверев

//

Журнал

микробиологии,

эпидемиологии и иммунобиологии. - 2014. - № 3. - С. 49-60.

2.

Максимова, О.В. Микробиота кишечника и ее связь с ожирением / В.В. Зверев,

О.В. Максимова, В.Б. Гервазиева // Инфекционные болезни. - 2014. - N 3. - С.69-

79.

3.

Мазурина, С.А.

IgE- и IgG- антитела к бактериальным антигенам у детей с

аллергическими заболеваниями и различным весом тела / С.А. Мазурина, О.В.

Максимова, В.А. Лысогора // Труды Международного форума «Клиническая

иммунология и аллергология — междисциплинарные проблемы». – Казань, 2014.

- С. 143.

4.

Поиск бактериоцинсинтезирующих клинических штаммов в бактериально-

грибных консорциумах / Л.П. Блинкова, Е.В. Зайцева, И.М. Ожован, Е.С.

Горбатко, О.В. Максимова, Ю.Д. Пахомов, М.Л. Никофорова, Т.П. Шмыгалева //

Тезисы 3 съезда микологов России. – 2014. – Современная микология в России. –

С. 339.

5.

Characteristics of the Gut Microbiota in Obese Children with Allergic Diseases / O.V.

Maksimova, V.V. Zverev, E.V. Zaitseva, L.P. Blinkova, V.B. Gervazieva // J Bacteriol

Parasitol. – 2014. - № 5. - P. 179. doi: 10.4172/2155-9597.1000179.

6.

Изучение бактериальной и грибной микрофлоры кишечника у детей с

аллергическими заболеваниями в зависимости от массы тела / О.В. Максимова,

Е.В. Зайцева, Л.П. Блинкова, И.М. Ожован // Успехи медицинской микологии. -

2014. - №13. - С. 65.

7.

Микробный пейзаж кишечника детей с аллергией в зависимости от веса / О.В.

Максимова,

В.А.

Ревякина,

Е.В.

Зайцева,

С.А.

Мазурина

//Труды

Международного форума «Клиническая иммунология и аллергология

междисциплинарные проблемы». - 2014. - С. 145.

8.

Микробиота кишечника у детей с ожирением и аллергическими заболеваниями /

О.В. Максимова, Е.В. Зайцева, С.А. Мазурина, В.А. Ревякина, В.Б. Гервазиева //

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2015. - №3. - С. 53-

59.

9.

Оценка микробиоты кишечника у детей с аллергическими заболеваниями / О.В.

Максимова, С.А. Мазурина, В.А. Ревякина, В.В. Зверев // Материалы XV

Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика

В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. - 2015. - № 17. - С. 70-71.

Список сокращений

ЖКТ – желудочно – кишечный тракт

СРБ – С- реактивный белок

ФНО – фактор некроза опухоли

ИЛ – интерлейкин



Похожие работы:

«Матафонова Галина Георгиевна КОМБИНИРОВАННЫЕ ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ЗАЩИТЫ ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ ОТ ОРГАНИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ И ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫХ ЭКСИЛАМП Специальность 03.02.08 – Экология (химия) (химические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Улан-Удэ – 2015 доктор биологических наук, профессор Батоев Валерий Бабудоржиевич Научный консультант: Официальные оппоненты: Лебедева Ольга...»

«Бучельников Анатолий Сергеевич Развитие теории интерцепторно-протекторного действия при совместном связывании биологически активных соединений с ДНК 03.01.02 Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Пущино 2015 Работа выполнена на кафедре Физика ФГАОУ ВО Севастопольский государственный университет Научный руководитель: Евстигнеев Максим Павлович, доктор физико-математических наук, профессор Официальные оппоненты:...»

«ВАКАРАЕВА МАЛИКА МОВСАРОВНА ДЕЙСТВИЕ ПОЛИАЗОЛИДИНАММОНИЯ, МОДИФИЦИРОВАННОГО ГИДРАТ-ИОНАМИ ЙОДА, НА УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск – 2015 Нечаева Ольга Викторовна, кандидат биологических наук Тихомирова Елена Ивановна, доктор биологических наук, профессор Научный руководитель:...»





 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.