авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

На правах рукописи

КУЗЬМИНА УЛЬЯНА ШАФКАТОВНА

РЕГУЛЯЦИЯ NMDA-РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ

У БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Уфа – 2015

Доктор биологических наук

Доктор медицинских наук

Доктор биологических наук, профессор кафедры

биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО

Башкирский государственный университет,

г. Уфа

Доктор медицинских наук, ведущий научный

сотрудник ФГБНУ Научный центр неврологии,

профессор кафедры нервных болезней

факультета фундаментальной медицины МГУ

имени М.В.Ломоносова, г. Москва

ФГБУН Институт мозга человека

им. Н.П.Бехтеревой Российской академии наук,

г. Санкт-Петербург

Научные руководители:

Вахитова Юлия Венеровна

Бахтиярова Клара Закиевна

Официальные оппоненты:

Веселов Станислав Юрьевич

Захарова Мария Николаевна

Ведущая организация:

Работа выполнена в лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии

Федерального государственного бюджетного учреждения науки

Института биохимии и генетики Уфимского научного центра

Российской академии наук

Защита диссертации состоится «___» сентября 2015 г. в «____» часов на заседании

диссертационного

совета

Д

002.133.01

при

Федеральном

государственном

бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного

центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, д. 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке

Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, проспект Октября, д. 71;

с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН:

vak.ed.gov.ru; ibg.anrb.ru, e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан «___» __________ 2015г.

Учёный секретарь диссертационного

совета Д 002.133.01

доктор биологических наук, доцент

Гульназ Фаритовна

Корытина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Рассеянный склероз (PC) – широко распространенное

хроническое

прогрессирующее

аутоиммунное

демиелинизирующее

нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), поражающее

преимущественно лиц молодого трудоспособного возраста и неизбежно ведущее к

инвалидизации (Столяров и др., 2008; Шмидт и др., 2012).

Существующие на сегодняшний день знания о РС позволяют рассматривать его

патогенез как сложный многокомпонентный процесс, ведущую роль в котором

играют аутоиммунные механизмы (Гусев и др., 2011). Установлено, что возможными

причинами срыва иммунологической толерантности и развития аутоиммунной

реактивности при РС являются нарушение функций, дифференцировки, а также

изменение субпопуляционного баланса эффекторных CD4+ Т-лимфоцитов (Kuchroo et

al., 2012; Raphael et al., 2014). Интенсивно изучается функциональная значимость в

инициации, формировании, прогрессии и ремиссии PC IL-17-продуцирующих CD4+

Т-клеток (Brucklacher-Waldert et al., 2009; Jadidi-Niaragh et al., 2011; Huber et al., 2013).

Особое внимание также уделяется определению роли эффекторных субпопуляций

CD8+ Т-лимфоцитов (Saxena et al., 2011; Gravano et al., 2013). Кроме того, большое

значение в формировании патологического процесса в мозге при РС имеет

избыточная

продукция

провоспалительных

цитокинов,

сопровождающаяся

снижением синтеза противовоспалительных цитокинов (Hollifield et al., 2003;

Mikulkova et al., 2010; Kallaur et al., 2013).

Помимо аутоиммунных механизмов, значительная роль в разрушении миелина,

гибели нейронов и, особенно, олигодендроцитов отводится нейромедиатору ЦНС

глутамату, который образуется в больших количествах в мозге при РС (Pitt et al.,

2000; Werner et al., 2000; Matute et al., 2001). Имеющиеся литературные данные

свидетельствуют

об

участии

глутамата

в

механизмах

нейровоспаления,

осуществляемом, в том числе за счет регуляции функций как поступивших в мозг

аутореактивных T-клеток, так и периферических T-лимфоцитов (Schori et al., 2001).

По данным ряда авторов, антагонисты NMDA-рецепторов мемантин и (+)-МК801

снижают

выраженность

неврологических

нарушений

у

животных

с

экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом, уменьшая воспаление в ЦНС

вследствие

ограничения

проницаемости

гемато-энцефалического

барьера

для

цитокинов и T-лимфоцитов, не препятствуя при этом развитию демиелинизации (Paul

et al., 2002; Abdurasulova et al., 2004).

К настоящему времени доказана экспрессия ионотропных рецепторов

глутамата (NMDA и AMPA подтипов) на поверхности T-клеток человека, а также

установлена их роль в регуляции ключевых функций иммунокомпетентных клеток,

таких как пролиферация и апоптоз, а также секреция цитокинов и дифференцировка

субпопуляций CD4+ T-лимфоцитов (Зайнуллина и др., 2011; Ganor et al., 2012). Важно

отметить, что на настоящий момент в доступной литературе имеются лишь

единичные работы, посвященные изучению роли глутаматных рецепторов NMDA

подтипа, экспрессированных на клетках иммунной системы, в функционировании

T-лимфоцитов больных с рассеянным склерозом.

Цель исследования – изучение роли NMDA-рецепторов в регуляции функций

Т-лимфоцитов у больных рассеянным склерозом.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить вовлеченность NMDA-рецепторов в регуляцию продукции про- и

противовоспалительных цитокинов Т-лимфоцитами, полученных от здоровых

лиц и больных рассеянным склерозом;

2. Охарактеризовать влияние NMDA-рецепторов на содержание CD4+ и СD8+

популяций Т-лимфоцитов и их соотношение у здоровых лиц и больных

рассеянным склерозом;

3. Исследовать

роль

NMDA-рецепторов

в

регуляции

дифференцировки

эффекторных субпопуляций CD4+ Т-лимфоцитов у здоровых лиц и больных

рассеянным склерозом;

4. Оценить

участие

NMDA-рецепторов

в

регуляции

дифференцировки

эффекторных субпопуляций СD8+ Т-лимфоцитов у здоровых лиц и больных

рассеянным склерозом;

5. Установить

спектр

генов,

дифференциально

регулируемых

NMDA-рецепторами,

склерозом.

в Т-клетках здоровых лиц и больных рассеянным

Научная новизна. В проведенном исследовании впервые получены данные о роли

NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов в иммунопатогенезе РС. Выявлены особенности

регуляции NMDA-рецепторами функций Т-клеток при РС. Охарактеризовано влияние

NMDA-рецепторов на секрецию и синтез Т-лимфоцитами, полученными от больных

РС доноров, провоспалительных (IFNγ, TNFα) и противовоспалительного (IL-10)

цитокинов, а также обладающего плейотропным действием IL-6. Показано, что

уменьшение секреции цитокинов при блокаде NMDA-рецепторов селективным

антагонистом

(+)-MK801

связано

с

ингибированием

экспрессии

генов

соответствующих белков. По сравнению со здоровыми донорами, у больных РС

данный негативный эффект блокады типа рецепторов менее выражен.

Показано, что блокада NMDA-рецепторов T-лимфоцитов антагонистом не

сопровождается изменением относительного количества CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов

и их соотношения у пациентов с PC и здоровых лиц.

Установлена вовлеченность глутаматных рецепторов NMDA подтипа в

регуляцию дифференцировки и поддержание баланса эффекторных субпопуляций

CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов при РС. Впервые показано ингибирующее действие

(+)-MK801 на экспрессию цитокинов (IL-4, IL-17, IFNγ) и генов транскрипционных

факторов (TBX21, GATA3, RORγt, FOXP3) при РС. Отмечено, что различные

субпопуляции CD4+ и CD8+ Т-клеток обладают разной чувствительностью к блокаде

NMDA-рецепторов. Так, у больных РС по сравнению со здоровыми лицами эффект

блокады NMDA-рецепторов был менее выражен в отношении Th1 и Tc1 клеток и

более – в отношении Th17 и Tс17 лимфоцитов. Выявлено, что блокада рецепторов

(+)-MK801 приводит к смещению субпопуляционного баланса CD4+ и CD8+

Т-лимфоцитов в сторону клеток 1 типа (Th1 и Tc1) в большей степени выраженному у

больных РС.

Идентифицированы паттерны генов, регулируемые NMDA-рецепторами у

здоровых лиц и пациентов с РС. Определены биологические процессы, в регуляцию

которых

могут

быть

вовлечены

NMDA-рецепторы

Т-лимфоцитов

при

РС.

Установлено ингибирующее влияние (+)-MK801 на экспрессию важных с точки

зрения патогенеза РС генов (CCL20, IL-8 и др.).

Научно-практическая значимость работы. Выполненная работа имеет как

фундаментальное,

так

и

практическое

значение.

Полученные

новые

экспериментальные данные расширяют и углубляют представления о роли

глутаматных рецепторов NMDA подтипа в регуляции функции Т-клеток и в развитии

иммунопатологических процессов при РС. Результаты проведенных экспериментов

раскрывают

возможные

механизмы,

посредством

которых

реализуются

иммуномодулирующие функции NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов, и позволяют

рассматривать

данные

рецепторы

в

качестве

новой

мишени

для

фармакотерапевтической коррекции РС

и, возможно, других аутоиммунных

демиелинизирующих заболеваний.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на

III Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), V Международной

школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома»

(Звенигород, 2012), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная

сигнализация» (Пущино, 2013), VI Российском Симпозиуме «Белки и пептиды»

(Уфа, 2013), 38-м Конгрессе Федерации европейских биохимических сообществ

«Биологические

механизмы»

(Санкт-Петербург,

2013),

VII

Сибирской

межрегиональной научно-практической конференции «Аутоиммунные заболевания

нервной

системы»

единство

и

многообразие»

(Новосибирск,

2015),

XX

Всероссийской

конференции

«Нейроиммунология.

Рассеянный

склероз»

(Санкт-Петербург, 2015).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе,

2 статьи в журнале из перечня ВАК.

Конкурсная

поддержка

работы.

Исследования

были

поддержаны

грантом

РФФИ № 15-04-01441 и грантом Президента РФ для ведущих научных школ

НШ – 5923.2014.4.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает следующие разделы:

введение, обзор литературы (глава 1), описание материалов и методов исследования

(глава 2), результаты исследования и их обсуждение (глава 3), заключение, выводы.

Список цитированной литературы включает 559 наименования, в том числе 46 работ

отечественных и 506 работ иностранных авторов. Работа изложена на 204 страницах

машинописного текста и иллюстрирована 15 таблицами, 13 рисунками.

Благодарности.

Автор

благодарит

сотрудников

лаборатории

молекулярной

иммунологии и фармакологии ИБГ УНЦ РАН за ценные советы в период подготовки

к защите диссертационной работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В

качестве

объекта

исследования

использовали

Т-лимфоциты

периферической крови условно-здоровых доноров-добровольцев и больных РС.

Клиническая характеристика доноров. В исследование было включено

60 больных с достоверным диагнозом РС согласно критериям W. McDonald (Polman

et al., 2005, 2011), состоящих на учете в Центре рассеянного склероза Республики

Башкортостан на базе РКБ им. Г.Г. Куватова (г. Уфа). Группа больных РС состояла из

37 женщин и 23 мужчин в возрасте от 19 до 68 лет (средний возраст 38.5 ± 11.5 лет).

Длительность заболевания была определена по году установления диагноза

неврологом и составила 5.3 ± 3.8 лет (от 1 до 15 лет). В соответствии с

классификацией,

предложенной

Lublin

и

соавторами

(1996)

ремиттирующе-

рецидивирующий тип течения заболевания РС был установлен у 28 пациентов. РС в

стадии вторичного прогрессирования наблюдался у 22 больных. Прогрессирующе-

ремиттирующий характер заболевание носило у 7, а первично-прогрессирующее -

у 3-х пациентов. Выраженность неврологического дефицита у больных РС была

определена врачом неврологом однократно на момент взятия крови с помощью

шкалы инвалидизации Куртцке в модификации Weiner и Elisson (1983) Expanded

Disability Status Scale (EDSS). Средний показатель по шкале EDSS составил 3.0 ± 1.2

балла (от 1 до 5 баллов), что говорит о преобладании числа пациентов с умеренной

степенью

инвалидизации.

Скорость

прогрессирования

заболевания

составила

1.0 ± 0.8 балл EDSS в год (от 0.2 до 1.3 балл EDSS / год). На момент забора крови у

всех пациентов наблюдалась стадия ремиссии заболевания, подтвержденная

неврологом.

Все

больные

РС,

участвующие

в

исследовании,

получали

иммуномодулирующую терапию препаратами, изменяющими течение РС (ПИТРС):

интерферон бета

принимали 36 человек, глатирамера ацетат 24 человека.

Контрольную группу составили 59 условно-здоровых добровольцев, среди которых

20 женщин и 39 мужчин. Средний возраст составил 28.9 ± 8.1 лет (от 21 до 54 лет).

Для участия в исследовании у всех доноров было получено письменное

информированное согласие. Работа получила одобрение в Локальном этическом

комитете при ИБГ УНЦ РАН.

Забор крови (20 мл) осуществлялся из локтевой вены в амбулаторных условиях.

Выделение мононуклеаров проводили по стандартной методике центрифугирования

в градиенте плотности фиколла (1.077 г/см3) (Boyum, 1968). Культивирование

лимфоцитов проводили в полной среде культивирования RPMI-1640, содержашей

10 % эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, США), 2 × 10-3 M

L-глутамина и 50 мкг/мл гентамицина сульфата (ПанЭко, Россия). В работе

использовали следующие методы стимуляции Т-клеток in vitro: инкубация

лимфоцитов с моноклональными антителами (МКА) к CD3 (аCD3 МКА, клон ОКТ3,

eBioscience, США) и к CD28 (aCD28 МКА, клон 37.51, BD PharmingenTM); добавление

в культуру клеток 4-форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА, 25 нг/мл) и иономицина

(1 мкг/мл). Для изучения роли NMDA-рецепторов в регуляции функций Т-клеток

данный вид рецепторов блокировали их неконкурентным антагонистом (+)-МК801

(10-4 М, Tocris, США). Определение содержание цитокинов проводили с помощью

коммерческих наборов для твердофазного иммуноферментного анализа «ИФА-IL6»,

«ИФА-IL10», «ИФА-TNFα», «ИФА-INFγ» (Цитокин, Россия). Оптическую плотность

образцов измеряли на мультипланшетном анализаторе «EnSpire® Multimode Plate

Readers» (Perkin Elmer, США) при 450 нм и референсной длине волны 650 нм.

Иммунофенотипирование

лимфоцитов

осуществляли

путем

поверхностного

окрашивания клеток МКА CD4-PE и CD8-PE-Cy5 в соответствии с протоколом

фирмы-изготовителя

(eBioscience,

США).

Флуоресценцию

регистрировали

на

проточном цитофлуориметре «Cytomics FC 500» (Beckman Coulter, США). В каждом

измерении регистрировали 30000 событий. Для определения внутриклеточного

уровня цитокинов Т-лимфоциты (2 × 106 кл/мл) окрашивали описанным выше

способом, затем фиксировали 1 %-ным параформальдегидом 10 мин при температуре

37 °С, пермеабилизовали 90 %-ным этанолом 30 мин при 4 °С. Далее лимфоциты

инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте с МКА к IFNγ-FITC,

IL-4-Alexa Fluor® 488, IL-17A-FITC (eBioscience, США), TGFβ1-СFS (R&D Systems,

США). В качестве отрицательного контроля использовали изотипические антитела,

рекомендованные производителем. Интенсивность флуоресценции детектировали с

помощью проточного цитофлуориметра «Cytomics FC 500» (Beckman Coulter, США).

В координатах малого углового (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния выделяли

область лимфоцитов и анализировали популяции CD4+ или CD8+ Т-лимфоцитов с

одновременной детекцией одного из исследуемых цитокинов. В каждом образце

анализировали 30000 событий. Последующую обработку данных проводили в

программе «FCS Express 4.0» (De Novo Software, Канада). Суммарную РНК выделяли

с использованием ТRI Reagent (MRC, США) в соответствии с протоколом фирмы-

изготовителя.

Последующие

выделение

и

очистку

проводили

с

помощью

коммерческого набора «Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit» (Zymo Research, США).

Количество и качество выделенных препаратов РНК контролировали с помощью

спектрофотометра NanoDrop 3000 (Thermo Scientific, США), а также электрофорезом

в 1 %-ном агарозном геле. кДНК получали из 0.5-2 мкг суммарной РНК реакцией

обратной транскрипции с использованием 0.5 мкг oligo(dT)12-18-праймеров или

«случайных» праймеров (наномеры) и 40 ед. акт. обратной транскриптазы

RevertAid™ Reverse Transcriptase (Thermo Scientific, США). Анализ экспрессии генов

осуществляли методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени на приборе «iQ™5

Multicolor RealTime PCR Detection System» (BioRad, США) c использованием

2.5

×

реакционной

смеси

«ПЦР-Микс»

(Синтол,

Россия),

содержащей

интеркалирующий краситель «SYBR Green I». В качестве внутреннего контроля были

использованы последовательности генов HPRT1 и PGK1. Праймеры к нуклеотидным

последовательностям анализируемых генов подбирали с помощью программы «Primer

3 Plus» (www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi) с последующим

анализом

в

программах

«DNAStar»

(LaserGene,

США)

и

«OligoAnalyzer»

(www.eu.idtdna.com), а также «BLAST» (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov). Изменения в

уровнях мРНК генов рассчитывали с использованием значений пороговых циклов с

помощью специализированной программы «REST Tool V. 2.0.7» (Corbertt Research,

CША).

Для

идентификации

генов,

экспрессия

которых

регулируется

NMDA-рецепторами, использовали коммерческий набор «Human Signal Transduction

PathwayFinder™ RT2 Profiler ™ PCR Array» (SABioscienses, США). Для проведения

реакции ОТ-ПЦР использовали набор «RT2 SYBR Green/Fluor qPCR Mastermix»

(SABioscienses, США) в соответствии с протоколом производителя. Результаты

ОТ-ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения «RT² Profiler PCR

Array

Data

Analysis

version

3.4»

(SABioscienses,

США).

Функциональный

кластерный анализ групп дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ)

проводили

с

помощью

биоинформационной

онлайн-программы

«DAVID»

(www.david.abcc.ncifcrf.gov)

и

классификационной

системы

«PANTHER»

( http://pantherdb.org ). Конструирование взаимосвязей белковых продуктов ДЭГ

проводили

с

использованием

программы

«STRING»

( http://string-db.org ).

Статистическую

обработку

полученных

результатов

производили

с

использованием

стандартного

пакета

программ

статистического

анализа

«Statistiсa 6.0» для Windows (StatSoft, США). Данные представлены в виде среднего

значения и стандартной ошибки среднего (М ± SEM). В случае распределения,

отличного от нормального, результаты описывали медианой с указанием в скобках

80 % – интерпроцентильного размаха (10-ая -90-ая процентили) (Ме (10 - 90 - процентили)).

Для выявления значимости различий между двумя независимыми выборками

(здоровые

доноры

и

доноры-больные

РС)

применяли

непараметрический

U-критерий

Манна-Уитни,

для

сравнения

зависимых

выборок

(внутри

экспериментальных групп) – t-критерий Вилкоксона. Различие групп считали

статистически достоверным при ρ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Регуляция NMDA-рецепторами продукции цитокинов Т-лимфоцитами

у здоровых доноров и доноров-больных рассеянным склерозом

С целью определения участия NMDA-рецепторов в регуляции эффекторных

функций Т-лимфоцитов нами было проведено изучение эффектов антагониста

NMDA-рецепторов (+)-MK801 на синтез и секрецию TNFα, IFNγ, IL-6, IL-10

Т-лимфоцитами в группах здоровых доноров и больных РС в системе in vitro.

Из полученных нами данных следует, что инкубирование активированных

через Т-клеточный рецептор (TCR) Т-клеток здоровых доноров с антагонистом

NMDA-рецепторов (+)-MK801 сопровождается статистически значимым снижением

уровня мРНК генов всех цитокинов. Интересно отметить, что блокада рецепторов в

большей степени влияет на экспрессию генов провоспалительных цинокинов IFNG и

TNFA (табл. 1, группы «aCD3/aCD28» и «aCD3/aCD28/(+)-MK801»).

Кроме

того,

при

блокаде

NMDA-рецепторов

стимулированных

Т-лимфоцитов также отмечается значительное снижение содержания в среде

культивирования исследуемых цитокинов (табл. 2, группы «aCD3/aCD28» и

«aCD3/aCD28/(+)-MK801»).

Аналогичное исследование нами проводилось и в группе больных РС,

результаты которого выявили схожие закономерности при оценке блокады

NMDA-рецепторов на синтез мРНК и секрецию про- и противовоспалительных

цитокинов Т-лимфоцитами. При совместной инкубации активированных клеток с

(+)-MK801 наблюдается снижение уровня мРНК генов всех цитокинов (табл. 1,

группы «aCD3/aCD28» и «aCD3/aCD28/(+)-MK801»). Однако более выраженное

ингибирование было обнаружено для мРНК, кодирующих гены IFNG и IFNB2.

Таблица 1 – Экспрессия генов цитокинов в Т-клетках здоровых и больных

рассеянным склерозом доноров на фоне блокады NMDA-рецепторов

Здоровые доноры (n=10)

группа

ген

CSIF

IFNB2

IFNG

TNFA

группа

ген

CSIF

IFNB2

IFNG

TNFA

aCD3/aCD28

+(+)-MK801

(+)-MK801

2.9

(1.0 - 4.0)

1.4

(1.1 - 1.8)

1.4

(1.2 - 1.9)

1.1

(0.7 - 1.9)

(+)-MK801

1.6

(0.5 - 2.6)

1.3

(0.8 - 2.0)

1.1

(0.4 - 1.3)

1.3

(0.7 - 1.8)

контроль

aCD3/aCD28

1.3

7.4

6.4

(1.1 - 1.8)

(5.1 - 14.8)*

(2.9 - 13.1)#

1.1

2.0

1.5

(1.0 - 1.5)

(1.9 - 2.5)*

(0.9 - 1.9)#

1.1

32.1

18.9

(1.0 - 1.4)

(16.4 - 82.3)*

(8.7 - 53.1)#

1.1

4.7

1.9

(1.0 - 1.5)

(3.0 - 10.9)*

(1.4 - 2.6)#

Больные РС доноры (n=10)

aCD3/aCD28

+(+)-MK801

контроль

aCD3/aCD28

1.1

1.7

1.2

(1.0 - 1.4)

(1.1 - 2.3)*

(1.1 - 1.4)#

1.0

1.4

1.0

(0.9 - 1.5)

(1.3 - 2.0)*

(0.9 - 1.3)#

1.1

54.6

39.6

(0.9 - 1.3)

(4.4 - 128.4)*

(3.2 - 112.2)

1.1

1.9

1.7

(1.0 - 1.2)

(1.1 - 2.8)*

(1.1 - 2.4)

Примечание – Для определения относительного уровня мРНК генов цитокинов

Т-лимфоциты (2×106 кл/мл) стимулировали aCD3/aCD28 МКА (2.5/1.25 мкг/мл) в

присутствии (+)-MK801 (10-4 М) в течение 8 часов (CSIF, IFNB2, TNFA) и 24 часов (IFNG).

Данные представлены в виде Me (10–90-процентили). Достоверность различий оценивали с

помощью U-критерия Манна-Уитни (здоровые доноры и доноры – больные РС) и t-критерия

Вилкоксона (внутри экспериментальных групп); * – ρ0.05; ** – ρ0.01 относительно группы

«контроль»; # – ρ0.05; ## – ρ0.01 относительно группы «aCD3/aCD28».

Результаты

анализа

содержания

цитокинов

в

среде

культивирования

Т-лимфоцитов, полученных от пациентов с РС, показали, что на фоне блокады

NMDA-рецепторов стимулированных Т-клеток происходит статистически значимое

снижение содержание IL-10, IFNγ и TNFα (табл. 2, группы «aCD3/aCD28» и

«aCD3/aCD28/(+)-MK801»). Изменений уровня IL-6 в среде культивирования

группа

цитокин

IL-10

(пг/мл)

IL-6

(пг/мл)

IFNγ

(пг/мл)

TNFα

(пг/мл)

группа

цитокин

IL-10

(пг/мл)

IL-6

(пг/мл)

IFNγ

(пг/мл)

TNFα

(пг/мл)

aCD3/aCD28

+(+)-MK801

(+)-MK801

контроль

aCD3/aCD28

126.9

1318.3

768.9

208.4

(109.3 - 146.8)

(498.9 - 2557.3)**

(314.7 - 1025.0)##

(151.7 - 244.2)**

2787.7

5208.8

(2581.2 - 3188.7)

(3360.2 - 7369.9)**

3874.4

12597.0

(3729.0 - 4161.4)

(7202.6 - 16927.6)**

705.9

2618.3

(553.0 - 1000.5)

(1815.6 - 3694.8)**

4161.5

(3211.3 - 4668.9)##

5089.3

(4378.4 - 6688.4)##

1324.2

(1170.3 - 1452.4)##

3993.8

(2111.9 - 4687.9)*

3580.3

(3336.7 - 3773.5)**

699.3

(558.0 - 979.0)

(+)-MK801

Больные РС доноры (n=20)

aCD3/aCD28

+(+)-MK801

контроль

aCD3/aCD28

стимулированных Т-лимфоцитов с (+)-MK801 обнаружено не было. Отметим, что

(+)-MK801 в наших экспериментальных условиях оказывал незначительное влияние

на уровнень мРНК и белков, исследуемых цитокинов как у здоровых доноров, так у

доноров-больных РС (табл. 1, группа «(+)-MK801»; табл. 2, группа «(+)-MK801»).

Таблица 2 – Цитокиновый профиль Т-лимфоцитов у здоровых доноров и

доноров-больных РС при блокаде NMDA-рецепторов

Здоровые доноры (n=20)

Примечание – Т-клетки (2×106 кл/мл) инкубировали в присутствии aCD3/aCD28 МКА

(2.5/1.25 мкг/мл) и (+)-MK801 (10-4 М) 24 часа (IL-10, IL-6, TNFα) и 48 часов (IFNγ).

Содержание цитокинов определяли в среде культивирования Т-лимфоцитов. Данные

представлены в виде Me (10–90-процентили). Достоверность различий оценивали с помощью

U-критерия Манна-Уитни (здоровые доноры и доноры – больные РС) и t-критерия

Вилкоксона (внутри экспериментальных групп); * – ρ0.05; ** – ρ0.01 относительно группы

«контроль»; # – ρ0.05; ## – ρ0.01 относительно группы «aCD3/aCD28».

Результаты

анализа

содержания

цитокинов

в

среде

культивирования

Т-лимфоцитов, полученных от пациентов с РС, показали, что на фоне блокады

NMDA-рецепторов стимулированных Т-клеток происходит статистически значимое

снижение содержание IL-10, IFNγ и TNFα (табл. 2, группы «aCD3/aCD28» и

«aCD3/aCD28/(+)-MK801»). Изменений уровня IL-6 в среде культивирования

стимулированных Т-лимфоцитов с (+)-MK801 обнаружено не было. Отметим, что

(+)-MK801 в наших экспериментальных условиях оказывал незначительное влияние

202.8

448.4

270.9

171.4

(96.4 - 300.7)

(155.7 - 737.2)*

(124.5 - 463.9)##

(100.6 - 285.9)*

158.6

301.7

306.1

137.3

(154.1 - 165.8)

(274.9 - 322.6)**

(301.5 - 313.2)

(131.1 - 145.3)**

339.9

1169.5

797.7

322.2

(325.9 - 356.9)

(315.5 - 2457.2)*

(245.3 - 1755.9)##

(304.0 - 333.5)**

60.4

206.5

129.0

58.8

(47.1 - 101.9)

(82.5 - 369.9)**

(64.0 - 205.1)##

(47.0 - 86.3)

на уровнень мРНК и белков, исследуемых цитокинов как у здоровых доноров, так у

доноров-больных РС (табл. 1, группа «(+)-MK801»; табл. 2, группа «(+)-MK801»).

Сравнительный анализ данных, полученных при изучении эффекта блокады

NMDA-рецепторов на цитокиновый статус активированных Т-лимфоцитов здоровых

и больных РС доноров, выявил следующие отличия. Так, согласно нашим данным,

подавление продукции TNFα было более выраженным у здоровых доноров по

сравнению с больными РС. Схожий характер влияния антагониста показан и для

IL-10. В условиях активации Т-клеток MKA снижение уровня секреции IFNγ на фоне

действия (+)-MK801 у здоровых доноров отличалось от больных РС почти в 2 раза.

Как уже отмечалось выше, блокада NMDA-рецепторов лимфоцитов у больных РС не

сопровождается изменениями содержания IL-6, тогда как у здоровых доноров эффект

антагониста составил всего 20 %. Следует отметить, что действие антагониста

NMDA-рецепторов схожим образом проявляется и на уровне мРНК генов

соответствующих цитокинов.

Таким образом, результаты проведенных нами исследований позволили

установить участие NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов в регуляции продукции как

про-, так и противовоспалительных цитокинов, реализуемое на уровне мРНК генов

соответствующих белков как у здоровых лиц, так и у больных РС, однако Т-клетки

больных

характеризуются

более

высокой

резистентностью

к

блокаде

NMDA-рецепторов по сравнению с клетками здоровых лиц.

Эффект (+)-MK801 на экспрессию генов транскрипционных факторов,

специфичных для Т-клеточных субпопуляций, в лимфоцитах здоровых доноров

и доноров-больных рассеянным склерозом

Известно, что процесс терминальной дифференциации CD4+ и CD8+

Т-лимфоцитов в эффекторные клетки в значительной степени определяется

активностью транскрипционных факторов (ТФ), специфичных для той или иной

субпопуляции Т-клеток. Так, формирование «провоспалительных» Th1 и Th17 клеток

регулируется транскрипционными факторами T-bet (TBX21) и RORγt (RORC),

соответственно (Szabo et al., 2000; Basu et al., 2013). Важную роль в дифференцировке

«противовоспалительных» Th2 клеток играет транскрипционный фактор GATA3

(GATA3), а ТФ FOXP3 (FOXP3) принимает участие в развитии регуляторных клеток

Treg (Pai et al., 2003; Okhura et al., 2013). Доказано, что данные ТФ регулируют

формирование субпопуляций CD8+ Т-лимфоцитов (Tс1, Tс2, Tс17, CD8+ Treg) (Yen et

al., 2009; Franceschini et al., 2012; Gol-Ara et al., 2012).

группа

ген

TBX21

GATA3

RORС

FOXP3

группа

ген

TBX21

GATA3

RORС

FOXP3

ФМА/ионо+

(+)-MK801

1.5

(0.6 - 2.3)#

0.2

(0.1 - 0.3)#

1.9

(0.6 - 3.0)#

0.2

(0.2 - 0.3)

ФМА/ионо+

(+)-MK801

0.8

(0.5 - 1.3)

0.3

(0.1 - 0.3) #

контроль

(+)-MK801

ФМА/ионо

0.9

0.9

1.2

(0.9 - 1.1)

(0.8 - 1.7)

(0.5 - 1.4)

1.0

1.4

0.23

(0.9 - 1.1)

(0.5 - 3.0)

(0.2 - 0.3)*

1.1

1.0

3.7

(0.7 - 1.2)

(0.6 - 1.6)

(2.6 - 4.4)*

1.1

1.1

0.2

(0.9 - 1.2)

(0.9 - 1.37)

(0.1 - 0.3)*

Больные РС доноры (n=15)

контроль

(+)-MK801

ФМА/ионо

При инкубации стимулированных индукторами дифференциации (ФМА и

иономицин) Т-клеток в присутствии антагониста NMDA-рецепторов (+)-МК801

отмечалось изменение относительного уровня мРНК генов ТФ (TBX21, GATA3,

FOXP3, RORC) в как у здоровых доноров, так и у доноров – больных РС. В частности,

блокада NMDA-рецепторов вызывала увеличение экспрессии гена TBX21 в среднем

на 24% и снижение уровня мРНК гена RORС в среднем на 50% (табл. 3, группы

«ФМА/ионо» и «ФМА/ионо/(+)-МК801»). Следует отметить, что у больных РС по

сравнению со здоровыми донорами блокада NMDA-рецепторов угнетала экспрессию

данных ТФ в большей степени.

Таблица 3 – Экспрессия генов транскрипционных факторов, специфичных

для субпопуляций Т-лимфоцитов, на фоне блокады NMDA-рецепторов Т-клеток

здоровых доноров и доноров-больных РС

Здоровые доноры (n=14)

1.0

1.4

(0.8 - 1.2)

(0.5 - 1.5)

0.9

0.9

(0.7 - 1.1)

(0.8 - 1.3)

1.0

0.8

(0.7 - 1.3)

(0.7 - 1.5)

1.1

1.0

(0.7 - 1.3)

(0.6 - 1.3)

0.7

(0.4 - 1.2)*

0.4

(0.3 - 0.6)*

1.2

0.6

(1.0 - 3.2)

(0.4 - 2.1)#

0.5

0.2

(0.3 - 0.7)*

(0.2 - 0.6) #

Примечание – Для моделирования дифференцировки Т-лимфоциты (2×106 кл/мл)

инкубировали с неспецифическими индукторами форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА)

и кальциевым ионофором иономицином (25 нг/мл и 1 мкг/мл, соответственно) в течение 4-х

часов и (+)-MK801 (10-4 М). Уровень мРНК генов транскрипционных факторов оценивали

методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Данные представлены в виде Me

(10 – 90 - процентили). Достоверность различий оценивали с помощью U-критерия Манна-

Уитни (здоровые доноры и доноры – больные РС) и t-критерия Вилкоксона (внутри

экспериментальных групп);* – ρ0.05 - относительно группы «контроль»;

– ρ0.05

относительно показателей в группе «ФМА/ионо».

#

Принимая во внимание тот факт, что баланс субпопуляций Т-клеток

определяет направленность и активность иммунного ответа, представлялось важным

оценить влияние блокады NMDA-рецепторов на данный параметр. О смещении

баланса субпопуляций судили по изменению соотношения экспрессии маркерных

ТФ. Согласно полученным данным, в условиях стимуляции клеток индукторами

дифференциации, действие (+)-МК801 приводит к увеличению соотношения

TBX21/GATA3 и TBX21/RORC в лимфоцитах здоровых индивидуумов, и менее

значимо – в Т-клетках больных РС, и, вероятно, к смещению баланса Тh1/Th2 и

Тh1/Th17 в сторону Th1 клеток. Помимо этого, в обеих экспериментальных группах

нами было зафиксировано уменьшение соотношения RORС/FOXP3 при инкубации

Т-клеток с (+)-MK801, что возможно, изменяет баланс между регуляторными Treg и

IL-17-продуцирующими CD4+ (CD8+) Т-лимфоцитами в сторону Treg клеток.

Таким образом, нами установлено, что NMDA-рецепторы участвуют в

регуляции направления дифференцировки эффекторных субпопуляций CD4+ и CD8+

Т-лимфоцитов посредством влияния на экспрессию генов ТФ, контролирующих

данный процесс. Действие антагониста (+)-MK801 на активность генов ТФ и их

соотношение у больных РС схоже с таковым у здоровых доноров, однако более

выражено.

Влияние (+)-МК801 на соотношение CD4+ и CD8+ Т-клеточных субпопуляций

у здоровых доноров и доноров-больных рассеянным склерозом

Для исследования возможного участия NMDA-рецепторов в регуляции

содержания основных популяций Т-лимфоцитов, мы оценили влияние (+)-MK801

(10-4 M) на процентное содержание СD4+ и СD8+ Т-клеток. Полученные данные

свидетельствуют о том, что блокада NMDA-рецепторов не оказывает влияния на

содержание CD8+ CD4+ клеток в группах здоровых индивидуумов и пациентов с РС

(табл. 4, группы «ФМА/ионо» и «ФМА/ионо/(+)-MK801»). Инкубация интактных

клеток с неконкурентным антагонистом (+)-MK801 не сопровождается изменениями

отношения CD4+/CD8+ (табл. 4, группы «контроль» и «(+)-MK801»). Подчеркнем, что

значения ИРИ во всех экспериментальных группах в обеих исследованных нами

группах доноров находились в диапазоне нормальных значений для данного

параметра (1.3 - 2.6).

Иммунологический

показатель

(% от общей

популяции Т-клеток)

%CD4+ T-клеток

%СD8+ T- клеток

CD4+/СD8+ (ИРИ)

Иммунологический

показатель

(% от общей

популяции Т-клеток)

%CD4+ T- клеток

%СD8+ T- клеток

CD4+/СD8+ (ИРИ)

Здоровые доноры (n = 20)

контроль

(+)-MK801

ФМА/ионо

ФМА/ионо/

(+)-MK801

48.8

47.3

45.3

44.2

(39.6 - 55.4)

(39.1 - 53.6)

(39.6 - 49.9)*

(39.0 - 49.4)*

29.5

30.0

31.0

31.2

(26.4 - 31.8)

(26.8 - 33.3)

(26.4 - 36.8)

(26.3 - 37.2)

1.7

1.6

1.5

1.4

(1.2 - 2.1)

(1.2 - 2.0)

(1.1 - 1.9)

(1.1 - 1.8)

Больные РС доноры (n = 20)

ФМА/ионо/

(+)-MK801

контроль

(+)-MK801

ФМА/ионо

48.1

48.7

45.2

43.5

(45.6 - 52.4)

(47.6 - 51.8)

(37.8 - 50.9)*

(37.0 - 49.5)*

31.2

31.1

35.0

35.6

(30.4 - 34.9)

(29.5 - 32.0)

(31.6 - 37.7)

(30.2 - 39.0)

1.6

1.6

1.35

1.2

(1.3 - 1.7)

(1.5 - 1.7)

(1.0 - 1.6)*

(1.0 - 1.6)*

Таблица 4 – Показатели клеточного иммунитета при блокаде

NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов здоровых и

больных рассеянным склерозом доноров

Примечание – Анализ СD4+ и СD8+ популяций Т-лимфоцитов проводили методом

проточной цитофлуориметрии после 4-х часовой стимуляции клеток ФМА (10 нг/мл) с

иономицином (1 мкг/мл) и (+)-MK801 (10-4 М). ИРИ – иммунорегуляторный индекс. Данные

представлены в виде Me (10 – 90 - процентили). Достоверность различий оценивали с

помощью U-критерия Манна-Уитни (здоровые доноры и доноры – больные РС) и t-критерия

Вилкоксона (внутри экспериментальных групп). * – ρ 0.05 относительно показателей в

группе «контроль».

Эффект блокады NMDA-рецепторов на направление дифференцировки

и баланс CD4+ Т-клеточных субпопуляций у здоровых доноров и

доноров-больных рассеянным склерозом

Учитывая выявленную нами вовлеченность NMDA-рецепторов в регуляцию

экспрессии

генов

ТФ,

контролирующих

дифференцировку

Т-клеточных

субпопуляций, нами были изучены последствия блокады NMDA-рецепторов на

субпопуляционный состав эффекторных CD4+ Т-лимфоцитов у здоровых лиц и

больных рассеянным склерозом. В условиях индуцированной ФМА/иономицином

дифференцировки Т-лимфоцитов нами было проведено определение относительного

содержания Th1, Th2, Th17 и Treg клеток в присутствии или отсутствии антагониста

NMDA-рецепторов (+)-MK801 (10-4 M) методом проточной цитофлуориметрии.

Воздействие

антагониста

NMDA-рецепторов

на

активированные

CD4+

T-лимфоциты

вызывает

снижение

процентного

содержания

IFNγ-,

IL-4-,

Субпопуляция

Тh-клеток

(% от общей популяции

Т-клеток)

%CD4+IFNγ+-клеток

%CD4+IL-4+-клеток

%CD4+IL-17+-клеток

Субпопуляция

Тh-клеток

(% от общей популяции

Т-клеток)

%CD4+IFNγ+-клеток

%CD4+IL-4+-клеток

%CD4+IL-17+-клеток

Группа

контроль

(+)-MK801

ФМА/ионо

0.1

0.1

4.0

(0.0 - 0.1)

(0.02 - 0.06)

(3.4 - 4.6) **

0.2

0.2

1.3

(0.0 - 0.2)

(0.1 - 0.2)

(1.1 - 1.6) **

0.0

0.0

0.4

(0.0 - 0.1)

(0.0 - 0.1)

(0.3 - 0.5) **

Больные РС доноры (n=20)

Группа

контроль

(+)-MK801

ФМА/ионо

0.0

0.0

5.1

(0.0 - 0.1)

(0.0 - 0.1)

(4.5 - 5.7) **

0.1

0.1

1.0

(0.1 - 0.2)

(0.1 - 0.1)

(0.9 - 1.2) **

0.0

0.0

0.4

(0.0 - 0.1)

(0.0 - 0.1)

(0.2 - 0.6) **

ФМА/ионо/

(+)-MK801

2.8

(2.3 - 3.3) #

1.0

(0.7 - 1.3) #

0.3

(0.2 - 0.4) #

ФМА/ионо/

(+)-MK801

4.3

(3.8 - 4.8) #

0.7

(0.5 - 0.9) ##

0.2

(0.1 - 0.3) ##

IL-17-продуцирующих клеток, полученных как от здоровых доноров, так и от

больных РС (табл. 5, группы «ФМА/ионо» и «ФМА/ионо/(+)-MK801»). Отметим, что

блокада NMDA-рецепторов стимулированных лимфоцитов доноров-больных РС

сопровождается уменьшением доли преимущественно IL-17-позитивных CD4+ клеток

по сравнению с IL-4- и IFNγ-секретирующими CD4+ клетками.

Таблица 5 – Содержание цитокин-секретирующих CD4+ Т-лимфоцитов

у здоровых доноров и доноров-больных РС на фоне блокады NMDA-рецепторов

Здоровые доноры (n=20)

Примечание – Т-клетки инкубировали с индукторами ФМА (25 нг/мл) и

иономицином 1 (мкг/мл) и (+)-MK801 (10-4 М) 4 часа. Принадлежность клеток к

субпопуляциям CD4+ Т-лимфоцитов оценивали по их способности к спонтанной и

ФМА/ионо - стимулированной внутриклеточной продукции маркерных цитокинов (IFN-γ,

IL-4, IL-17) Содержание цитокин-секретирующих клеток определяли методом проточной

цитофлуориметрии. Данные представлены в виде Me (10% – 90%). Достоверность различий

оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни (здоровые доноры и доноры – больные РС)

и t-критерия Вилкоксона (внутри экспериментальных групп). * – ρ0.05; ** – ρ0.01

относительно группы «контроль»; # – ρ0.05; ## – ρ0.01 относительно группы «ФМА/ионо».

Обращает на себя внимание факт более выраженного подавления синтеза IL-17

CD4+ лимфоцитами больных РС при сравнении с аналогичным показателем здоровых

доноров. В тоже время, в группе пациентов продукция IFNγ CD4+ клетками на фоне

антагониста NMDA-рецепторов ингибирована в меньшей степени по сравнению со

здоровыми индивидуумами. Таким образом, сопоставление данных показало, что у

больных РС, в отличие от здоровых лиц, Th2 и Th17 клетки более чувствительны, а

Th1 – менее чувствительны к действию антагониста NMDA-рецепторов.

Последующий

анализ

соотношений

CD4+IFNγ+/CD4+IL-4+

(Th1/Th2)

и

CD4+IFNγ+/CD4+IL-17+ (Th1/Th17), являющихся маркерами Th-субпопуляционного

баланса, выявил смещению баланса Th1 и Th2 клеток в сторону Th1 как у здоровых

доноров, так и у больных РС. Помимо этого, анализ соотношения Th1/Th17 также

показал изменение баланса между данными субпопуляциями в сторону Th1 клеток. К

сожалению, в наших экспериментальных условиях нам не удалось провести детекцию

CD4+TGFβ1+

субпопуляции

Т-клеток

ввиду

их

чрезвычайно

низкой

представленности, в связи с чем данные о влиянии блокады глутаматных рецепторов

NMDA подтипа на Тreg клетки и баланс Th17/Тreg не представлены.

Таким образом, полученные нами данные позволяют предположить участие

NMDA-рецепторов в «тонкой» регуляции направления дифференцировки CD4+

Т-лимфоцитов. У больных РС изменения субпопуляционного состава CD4+ Т-клеток,

наблюдаемые на фоне действия (+)-MK801, выражены сильнее, чем у здоровых лиц.

Эффект блокады NMDA-рецепторов на направление дифференцировки

и баланс CD8+ Т-клеточных субпопуляций

Следующим

этапом

нашего

исследования

было

изучение

действия

неконкурентного антагониста NMDA-рецепторов (+)-MK801 на содержание Tс1

(CD8+IFNγ+), Tс2 (CD8+IL-4+) и Tс17 (CD8+IL-17+) клеток у здоровых лиц и больных

рассеянным склерозом. В связи с отсутствием специфических маркеров CD8+ Treg и

трудностью их идентификации (Gol-Ara et al., 2012) нами не проводилась оценка

влияния блокады глутаматных рецепторов NMDA подтипа на данную субпопуляцию

Т-клеток.

Как следует из данных, представленных в таблице 6, (+)-MK801 не оказывает

влияние на содержание IFNγ-, IL-4- и IL-17- продуцирующих CD8+ Т-клеток как в

группе

здоровых

доноров,

так

и

больных

РС.

Экзогенная

стимуляция

ФМА/иономицином сопровождается увеличением содержания маркерных цитокинов

в CD8+ Т-лимфоцитах здоровых лиц и больных РС. При блокаде NMDA-рецепторов

выявлено существенное снижение содержания IL-17-продуцирующих CD8+ клеток у

больных РС и менее выраженное, статистически достоверное, уменьшение данного

параметра у здоровых доноров. Индуцированный синтез IL-4 при действии

антагониста NMDA-рецепторов был подавлен как в группе пациентов с РС, так и у

здоровых индивидуумов.

Согласно полученным данным отдельные субпопуляции CD8+

Т-клеток

проявляют

разную

чувствительность

к

действию

антагониста.

Менее

чувствительными оказались Tс1 клетки, тогда как большую чувствительность к

эффекту (+)-MK801 проявили Tс17 клетки.

Таблица 6 – Содержание цитокин-секретирующих CD8+ Т-лимфоцитов

у здоровых доноров и доноров-больных РС

на фоне блокады NMDA-рецепторов

Здоровые доноры (n=15)

Субпопуляция

Тc-клеток

(% от общей популяции

Т-клеток)

%CD8+IFNγ+-клеток

%CD8+IL-4+-клеток

%CD8+IL-17+-клеток

Субпопуляция

Тc-клеток

(% от общей популяции

Т-клеток)

%CD8+IFNγ+-клеток

%CD8+IL-4+-клеток

%CD8+IL-17+-клеток

Группа

ФМА/ионо

ФМА/ионо+

(+)-MK801

контроль

(+)-MK801

0.0

0.0

(0.0 - 0.1)

(0.0 - 0.1)**

0.0

0.0

(0.0 - 0.1)

(0.0 - 0.1)**

0.1

0.1

(0.0 - 0.1)

(0.0 - 0.1)**

8.2

6.1

(6.9 - 10.5)**

(4.9 - 7.9)#

0.9

0.7

(0.6 - 1.2)**

(0.5 - 0.9)##

0.3

0.1

(0.1 - 0.5)**

(0.1 - 0.2)##

Больные РС доноры (n=15)

Группа

контроль

(+)-MK801

ФМА/ионо

ФМА/ионо+

(+)-MK801

0.1

(0.0 - 0.1)

0.1

(0.0 - 0.1)

0.0

(0.0 - 0.1)

0.1

15.8

12.4

(0.0 - 0.1)*

(10.1 - 17.5)**

(9.0 - 13.8)#

0.1

1.2

0.7

(0.0 - 0.1)**

(0.8 - 1.9)**

(0.5 - 0.9)#

0.0

0.3

0.1

(0.0 - 0.1)*

(0.2 - 0.4)**

(0.1 - 0.2)##

Примечание – Т-клетки инкубировали с индукторами ФМА (25 нг/мл) и

иономицином 1 (мкг/мл) и (+)-MK801 (10-4 М) 4 часа. Принадлежность клеток к

субпопуляциям CD8+ Т-лимфоцитов оценивали по их способности к спонтанной и

ФМА/ионо - стимулированной внутриклеточной продукции маркерных цитокинов (IFN-γ,

IL-4, IL-17) Содержание цитокин-секретирующих клеток определяли методом проточной

цитофлуориметрии. Данные представлены в виде Me (10% – 90%). Достоверность различий

оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни (здоровые доноры и доноры – больные РС)

и t-критерия Вилкоксона (внутри экспериментальных групп). * – ρ0.05; ** – ρ0.01

относительно группы «контроль»; # – ρ0.05; ## – ρ0.01 относительно группы «ФМА/ионо».

Анализ

изменения

соотношений

CD8+IFNγ+/CD8+IL-4+

(Tс1/Tс2)

и

CD8+IFNγ+/CD8+IL-17+ (Tс1/Tс17) на фоне блокады NMDA-рецепторов показал

увеличение соотношения Tс1/Tс2 и Tс1/Tс17, что свидетельствует о смещении

баланса в сторону Tс1 у здоровых доноров. У больных РС наблюдалась аналогичная

тенденция, однако, более выраженная.

Таким образом, показано, что NMDA-рецепторы участвуют в тонкой регуляции

процесса и направления дифференцировки эффекторных субпопуляций CD4+ и CD8+

Т-лимфоцитов, как у здоровых лиц, так и у больных РС. Полученные данные об

эффектах (+)-MK801 на Т-лимфоциты больных РС отражают важность данного типа

рецепторов в патогенезе РС и подчеркивают перспективность использования данного

подтипа рецепторов в качестве мишени для разработки новых терапевтических

подходов.

Гены, дифференциально экспрессирующиеся при блокаде

NMDA-рецепторов в Т-клетках у здоровых доноров и

доноров-больных рассеянным склерозом

Поиск паттернов генов, регулируемых NMDA-рецепторами Т-клеток, был

проведен с использованием коммерческого набора «Human Signal Transduction

PathwayFinder PCR Array» в условиях TCR-опосредованной активации Т-клеток.

В ходе сравнительного анализа экспрессии 84 генов, представляющих

18 различных путей передачи сигнала, нами по результатам трех независимых

экспериментов

были

установлены

изменения

уровня

мРНК

24

генов

в

aCD3/aCD28-активированных Т-лимфоцитах на фоне действия (+)-MK801. Данные,

полученные с помощью коммерческого набора, далее верифицировали методом

ОТ-ПЦР в режиме реального времени (n=10). Результаты нормализовали по уровню

экспрессии гена «домашнего хозяйства» HPRT1. Совокупные данные по результатам,

полученным с помощью набора и ОТ-ПЦР, представлены в таблице 7.

При помощи онлайн ресурса «STRING» был проведен анализ возможных

взаимодействий среди 12 продуктов генов, экспрессия которых изменилась при

блокаде NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов. Реконструкция сети белок-белковых

взаимодействий показала взаимосвязь 8 из 12 генов. С использованием программы

«STRING» были установлены потенциальные функциональные партнеры выявленных

генов,

среди

которых

TF

(трансферрин),

TP53

(белок

р53),

DIABLO

(митохондриальный белок, связывающий ингибиторы апоптоза, IAP), TRAF1 (фактор

1, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли), TRAF2 (фактор 2,

ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли), CDK4 (циклин-зависимая

киназа 4), CDK6 (циклин-зависимая киназа 6), MDM2 (онкоген, E3-лигаза системы убиквитин-

зависимого протеолиза), PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток), CASP9

(каспаза 9).

Последующий in silico анализ выявленных групп генов с помощью

биоинформационного ресурса «DAVID» (Huang et al., 2009) и классификационной

Изменение

Достоверность

уровня экспрессии

отличий (р)

1.00 ± 0.13

-

0.02 ± 0.01

0.00

0.14 ± 0.02

0.00

0.25 ± 0.04

0.00

0.32 ± 0.01

0.02

1.73 ± 0.22

0.04

2.13 ± 0.30

0.03

3.18 ± 0.31

0.03

3.37 ± 0.32

0.01

5.66 ± 0.24

0.00

18.02 ± 2.11

0.00

53.11 ± 1.98

0.00

77.04 ± 5.11

0.00

Название гена

Путь передачи сигнала

HPRT1

-

IL4R

Jak-STAT

VCAM1

NF-κB; PLC-зависимый путь

IL4

Jak-STAT

GADD45A

p53

BIRC2

NF-κB

BAX

p53

HSPB1

стрессовый путь

инозитол-3 киназа/АКТ; Ca2+-

и PKC- зависимый путь

MYC

CDKN2A

TGFβ-зависимый путь

TFRC

Ca2+ и PKC-зависимый путь

GYS1

инсулин-зависимый путь

MMP7

инозитол-3 киназа/АКТ-путь

системы «PANTHER» (Thomas et al., 2003) показал, что данные генов участвуют в

регуляции таких ключевых функций Т-лимфоцитов, как пролиферация (IL4, VCAM1,

CDKN2A), апоптоз (BAX, MYC, CDKN2A, HSPB1) активация (IL4R, IL4, VCAM1,

CDKN2A) и дифференцировка (IL4, VCAM1, BAX).

Таблица 7 – Дифференциальная экспрессия генов в Т-клетках здоровых

доноров при блокаде NMDA-рецепторов на фоне TCR-опосредованной активации

В ходе исследования экспрессионного профиля антиген-активированных

Т-лимфоцитов, полученных от пациентов с РС, на фоне блокады NMDA-рецепторов

нами выявлено 37 из 84 генов, изменяющих уровень экспрессии в Т-клетках в ответ

на действие антагониста (+)-MK801. Дальнейшее подтверждение полученных

результатов с использованием ОТ-ПЦР в режиме реальном времени подтвердила

изменения экспрессионного статуса для 20 из 37 генов (табл. 8, n=6).

Анализ взаимодействий белковых продуктов 20 генов, проведенный с

помощью программы «STRING», показал, что продукты 12 из 20 генов образуют

взаимосвязанную

сеть.

Согласно

данным

программы,

потенциальными

функциональными партнерами выявленных ДЭГ, могут являться гены, кодирующие

белки JUN (протоонкоген, фактор транскрипции с-Jun), CDK2 (циклин-зависимая

киназа 2), CDK4 (циклин-зависимая киназа 4), IGF1 (инсулиноподобный фактор роста

1),

CCND1

(циклин

D1),

CCND3

(циклин

D3),

CSF2RA

(рецептор

колониестимулирующего фактора), SKP2 (киназа-ассоциированный белок S-фазы 2),

CDC37 (ко-шаперон белка теплового шока HSP90), CASP8 (каспаза 8).

Функциональный анализ групп генов с помощью баз данных «DAVID» и

«PANTHER» выявил, что блокада NMDA-рецепторов сопровождается изменением

экспрессии генов, вовлеченных в процессы апоптоза (BAX, FAS, NAIP, BIRC3,

Изменение

Достоверность

уровня экспрессии

отличий (р)

1.00 ± 0.13

-

0.15 ± 0.02

0.03

0.15 ± 0.02

0.00

0.17 ± 0.02

0.02

0.20 ± 0.05

0.00

0.21 ± 0.01

0.00

0.26 ± 0.03

0.00

0.27 ± 0.06

0.01

0.28 ± 0.03

0.002

0.29 ± 0.02

0.00

0.30 ± 0.02

0.04

0.31 ± 0.03

0.03

0.32 ± 0.06

0.00

0.34 ± 0.02

0.01

0.34 ± 0.03

0.04

0.34 ± 0.04

0.02

0.36 ± 0.03

0.01

0.39 ± 0.04

0.01

0.40 ± 0.06

0.03

0.45 ± 0.11

0.04

5.06 ± 0.95

0.04

Название гена

Путь передачи сигнала

HPRT1

-

BIRC3

NF-κB

FASN

Инсулин-зависимый путь

CSF2

Ca2+ и PKC- зависимый путь

GADD45A

p53

BCL2A1

NF-κB

HSP90AA2

стрессовый путь

IL8

NF-κB

CDKN1B

TGFβ путь

IGFBP3

p53

CCL20

NF-κB

PTCH1

Hedgehog-путь

ODC1

Ca2+ и PKC-зависимый путь

IL2

NF-κB

FOS

стрессовый путь

EN1

путь ретиноевой кислоты

CDKN1B, GADD45A, MYC), контроля клеточного цикла (CDKN1B, GADD45A, MYC,

FOS), клеточной активации (FAS, CCL20, CSF2, IL2, IL8), регуляции цитокиновой

системы (FAS, CCL20, CSF2, IGFBP3, IL2, IL8), фосфорилирования (CSF2, CDKN1B,

GADD45A, IGFBP3, IL2).

Таблица 8 – Дифференциальная экспрессия генов в Т-клетках доноров-больные РС

при блокаде NMDA-рецепторов на фоне TCR-опосредованной активации

инозитол-3 киназа/АКТ; Ca2+-

и PKC-зависимый путь

MYC

NAIP

стрессовый путь

HOXA1

путь ретиноевой кислоты

FAS

p53

WISP1

Wnt-путь

Таким образом, впервые были идентифицированы гены и сигнальные пути,

регулируемые NMDA-рецепторами Т-клеток у здоровых лиц и больных РС. Более

того, подтверждено предположение о том, что NMDA-рецепторы Т-лимфоцитов

участвуют в модуляции жизненноважных функций клеток иммунной системы при РС.

ВЫВОДЫ

1.

Исследовано

влияние

NMDA-рецепторов

на

секрецию

и

синтез

Т-лимфоцитами, полученными от больных РС доноров, провоспалительных (IFNγ,

TNFα)

и

противовоспалительных

(IL-10)

цитокинов,

а

также

обладающего

плейотропным действием IL-6. Показано, что уменьшение секреции при блокаде

NMDA-рецепторов селективным антагонистом (+)-MK801 связано с ингибированием

экспрессии генов соответствующих цитокинов. По сравнению со здоровыми

донорами, у больных РС негативный эффект блокады данного подтипа глутаматных

рецепторов выражен слабее.

2. Показано, что блокада NMDA-рецепторов T-лимфоцитов неконкурентным

антагонистом (+)-MK801 не сопровождается изменением иммунорегуляторного

индекса (ИРИ, соотношения содержания CD4+/CD8+ Т-клеток) у пациентов с PC и

здоровых лиц.

3. Установлен ингибирующий эффект блокады NMDA-рецепторов на процесс

дифференцировки эффекторных субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов больных

РС. Показано подавление (+)-MK801 экспрессии генов ключевых транскрипционных

факторов GATA3, FOXP3, RORγt и увеличение уровня мРНК гена, кодирующего

TBX21. При блокаде глутаматных рецепторов NMDA подтипа выявлено снижение

относительного содержания IFNγ-, IL-4-, IL-17-продуцирующих субпопуляций CD4+

и CD8+, в большей степени выраженное у больных РС.

4. Показано, что различные субпопуляции CD4+ и CD8+ Т-клеток обладают

разной чувствительностью к блокаде NMDA-рецепторов. Так, у больных РС по

сравнению со здоровыми лицами эффект блокады NMDA-рецепторов оказался более

значимым в отношении Th17 и Tс17 клеток.

5. Сопоставление данных, полученных при исследовании влияния блокады

NMDA-рецепторов на субпопуляционный баланс CD4+

и CD8+ Т-клеток здоровых

доноров и больных РС, показало у последних большее смещение направления

дифференцировки лимфоцитов в сторону Th1 и Tс1 клеток.

6. Выявлено, что блокада NMDA-рецепторов приводит к количественным

изменениям уровней мРНК ряда генов, задействованных в различных сигнальных

путях и биологических процессах в Т-лимфоцитах при РС, таких как апоптоз,

клеточный цикл, пролиферация, продукция цитокинов и дифференцировка.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.

Фаткуллина (Кузьмина) У.Ш. NMDA-рецепторы Т-лимфоцитов регулируют

синтез цитокинов у больных рассеянным склерозом / У.Ш. Фаткуллина,

Л.Ф. Зайнуллина, К.З. Бахтиярова, Ю.В. Вахитова // Иммунология. – 2013. - Т.34. -

№6. - С.339-343.

2.

Кузьмина У.Ш. NMDA-рецепторы регулируют продукцию IL-17 CD4+ и CD8+

Т-клетками при рассеянном склерозе / У.Ш. Кузьмина, Л.Ф. Зайнуллина,

К.З. Бахтиярова, Ю.В. Вахитова // Иммунология. - 2015. - Т.36. - №1. - С. 13-18.

3.

Фаткуллина (Кузьмина) У.Ш. Регуляция NMDA-рецепторами Т-лимфоцитов

экспрессии генов, специфичных для Th субпопуляций, у больных рассеянным

склерозом / У.Ш. Фаткуллина, С.М. Фаррахова, К.З. Бахтиярова, Ю.В. Вахитова //

Цитология. - 2012. - Т. 54. - №9. - С. 711-712.

4.

Фаткуллина (Кузьмина) У.Ш. Регулируемая NMDAR экспрессия генов в

лимфоцитах больных рассеянным склерозом / У.Ш. Фаткуллина, С.М. Фаррахова,

К.З. Бахтиярова, Ю.В. Вахитова // V Международная школа молодых ученых по

молекулярной генетике «Непостоянство генома», Москва. - 2012. - С. 65.

5.

Фаткуллина

(Кузьмина)

У.Ш.

Поиск

генов,

регулируемых

NMDA-рецепторами,

в

Т-лимфоцитах

человека

/

Л.Ф.

Зайнуллина,

У.Ш. Фаткуллина, Ю.В. Вахитова // V Международная школа молодых ученых по

молекулярной генетике «Непостоянство генома», Москва. - 2012. - С. 27.

6.

Фаткуллина (Кузьмина) У.Ш. Идентификация путей сигнальной трансдукции

от NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах / Л.Ф. Зайнуллина, У.Ш. Фаткуллина,

Ю.В. Вахитова // Рецепторы и внутриклеточная сигнализация. Сборник статей.

Москва.- 2013. - Т. 1. - С. 28-33.

7.

Кузьмина У.Ш. Роль NMDA-рецепторов в регуляции функций Т-лимфоцитов

человека / Л.Ф. Зайнуллина, У.Ш. Кузьмина, Э.Р. Кудояров, В.А. Вахитов // VI

Российский симпозиум «Белки и пептиды», Уфа. - 2013. - С. 82.

8.

Fatkullina (Kuzmina) U.Sh. The subunit composition of NMDA-receptors in

human T-lymphocytes / L. Zainullina, U.Sh. Fatkullina, Y.V. Vakhitova // 38th FEBS

Congress “Mechanisms in Biology”, Saint Petersburg. - 2013. - P. 192.

9.

Fatkullina (Kuzmina) U.Sh. The involvement of NMDA-receptors in cytokine

production of T-lymphocytes in MS / U.Sh. Fatkullina and Y.V. Vakhitova // 38th FEBS

Congress “Mechanisms in Biology”, Saint Petersburg. - 2013. - P. 275.

10.

Кузьмина У.Ш. Влияние NMDA-рецепторов на дифференцировку CD4+

T-клеток

при

рассеянном

склерозе

/

У.Ш.

Кузьмина,

К.З.

Бахтиярова,

Ю.В.

Вахитова

//

Материалы

VII

Сибирской

межрегиональной

научно-

практической конференции «Аутоиммунные заболевания нервной системы» -

единство и многообразие», Новосибирск.- 2015.- С. 14.

11.

Кузьмина У.Ш.

Участие глутаматных рецепторов NMDA подтипа в

иммунопатогенезе рассеянного склероза / У.Ш.

Кузьмина, К.З.

Бахтиярова,

Ю.В. Вахитова // Нейроиммунология. - 2015. - Т. XII. -№ 1-2. - С. 61-62.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДЭГ – дифференциально экспрессирующиеся гены; ИРИ – иммунорегуляторный

индекс; МКА – моноклональные антитела; PC – рассеянный склероз; ФМА 4-форбол-

12-миристат-13-ацетат; NMDA – N-метил-D-аспартат; Tс – цитотоксические Т-лимфоциты;

TCR – Т-клеточный рецептор; Th – Т-хелперные клетки.







 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.