авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

На правах рукописи

Колесникова Алиса Станиславовна

АНОКТАМИНЫ ВКУСОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ: КЛОНИРОВАНИЕ,

ЭКСПРЕССИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ

03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пущино – 2016

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Идентификация ионных каналов, вовлеченных в сигнальные

процессы во вкусовых клетках млекопитающих, является актуальной проблемой,

поскольку молекулярные механизмы детекции вкусовых стимулов и принципы

кодирования вкусовой информации во многом остаются неизученными. В настоящий

момент не вызывает сомнения то обстоятельство, что вкусовая трансдукция протекает при

участии фосфоинозитидного каскада, который обеспечивает сопряжение молекулярных

рецепторов вкусовых веществ с мобилизацией внутриклеточного кальция. Стимул-

зависимые Са2+-сигналы затем конвертируются Са2+-активируемым катионным каналом

TRPM5 в деполяризацию вкусовых клеток с последующим выбросом афферентного

нейромедиатора АТР. По имеющимся данным межклеточные коммуникации во вкусовой

почке протекают при участии ряда первичных медиаторов, которые также стимулируют

кальциевую сигнализацию во вкусовых клетках (Chaudhari, 2014). Следует отметить, что

Са2+-зависимые ионные каналы обеспечивают сопряжение внутриклеточных Са2+-

сигналов с поляризацией плазматической мембраны в самых разнообразных клетках. В

этом отношении вкусовые клетки не являются исключением. Так, в лаборатории

молекулярной физиологии клетки ИБК РАН ранее было показано, что в субпопуляции

вкусовых клеток пуринергические агонисты стимулируют метаботропные рецепторы P2Y

типа с последующей мобилизацией внутриклеточного кальция и активацией анионных

каналов, управляемых Са2+ (Kim et al., 2000; Baryshnikov et al., 2003; Bystrova et al., 2007).

Молекулярная природа последних до сих пор не установлена. Белки из семейства

аноктаминов (Ано) выполняют самые разнообразные функции и найдены в различных

клеточных типах. Первые два представителя этого семейства Ано1 и Ано2 способны

формировать хлорные каналы, активируемые кальцием (СаСС-каналы). Известно, что в

хемосенсорных системах СаСС-каналы играют особую роль, они вовлечены в

обонятельную рецепцию и детекцию феромонов. В обонятельных и вомеронасальных

нейронах активация CaCC служит дополнительным механизмом усиления рецепторного

потенциала, повышающим чувствительность систем детекции запахов и феромонов на

клеточном уровне. К настоящему времени установлено, что Ано1 и Ано2 отвечают за

кальций-зависимый хлорный ток в двух видах хемосенсорных клеток - в обонятельных и

вомеронасальных нейронах (Sagheddu et al, 2010; Dibattista et al, 2012; Saidu et al, 2013).

Аноктамины вкусовых клеток не были исследованы. В свете вышеизложенного

актуальной задачей является исследование аноктаминов вкусовых клеток, поскольку это

будет способствовать выявлению молекулярной природы функционирующих в них СаСС-

каналов.

Цели и задачи работы. Целью данной работы было исследовать аноктамины вкусовых

клеток мыши в качестве возможных кандидатов на роль функционирующих в них СаСС-

каналов. Для выполнения данной цели были сформулированы следующие задачи:

1.

мыши.

2.

Провести экспрессионный анализ генов семейства аноктаминов во вкусовой почке

Клонировать полноразмерные комплементарные ДНК Aнo1 и Aнo2 из вкусовых

почек мыши и сконструировать рекомбинантные плазмиды для гетерологической

1

экспрессии

кДНК

этих

белков

с

целью

последующего

исследования

их

фармакологического профиля и биофизических характеристик.

3.

Изучить локализацию мРНК генов Aнo1 и Aнo2 во вкусовых почках с

использованием гибридизации in situ смысловых и антисмысловых рибопроб на

криосрезах желобоватого вкусового сосочка языка.

4.

Исследовать локализацию Ано1 и Ано2 в желобоватом вкусовом сосочке с

помощью методов иммуногистохимии и иммунофлуоресцентного анализа.

5.

С использованием метода глобальной амплификации мРНК и последующего

экспрессионного анализа одиночных клеток выявить, в клетках какого типа во вкусовой

почке локализованы транскрипты Ано1 и Ано2.

Научная новизна и практическая ценность работы. Данная работа является

пионерским исследованием семейства аноктоминов в периферической вкусовой системе

млекопитающих и представляет собой первый шаг в направлении молекулярной

идентификации СаСС-каналов, функционирующих во вкусовых клетках мыши. Основные

результаты получены впервые. Впервые проведен экспрессионный анализ генов

семейства аноктаминов в препарате РНК, выделенной из вкусовых почек желобоватого

вкусового сосочка языка мыши, и выявлены сплайс-варианты Ано1 и Ано2. Впервые

клонированы полноразмерные кДНК генов Ано1 и Ано2 из вкусовой ткани мыши.

Сконструированы плазмиды для экспрессии клонированных кДНК, слитых с геном

зеленого флуоресцентного белка, и впервые показано, что рекомбинантные аноктамины,

клонированные из вкусовой ткани мыши, в гетерологической системе экспрессии

индуцируют появление Са2+-активируемой анионной проводимости плазматической

мембраны, во многом сходной по биофизическим характеристикам с проводимостью

мембран вкусовых клеток. С помощью гибридизации in situ смысловых и антисмысловых

рибопроб

впервые

выявлена

специфическая

локализация

транскриптов

мРНК

аноктаминов 1 и 2 во вкусовых почках желобоватого сосочка языка мыши. Впервые

изучена локализация Ано1 и Ано2 во вкусовой ткани с помощью иммуногистохимии и

иммунофлуоресцентного анализа.

Впервые исследовано распределение транскриптов

Ано1 и Ано2 среди одиночных вкусовых клеток типов I, II и III, изолированных из

вкусовой почки мыши. При исследовании одиночных клеток выявлены межклеточные

вариации в уровне экспрессии бета-актина, и высказано предположение, что бета-актин не

может служить надежным контролем при экспрессионном анализе одиночных клеток.

Полученные в работе данные расширяют существующие представления о молекулярной

природе Са2+-активируемых анионных каналов, функционирующих во вкусовых клетках

млекопитающих.

Сконструированные

плазмиды

могут

быть

использованы

для

исследования фармакологического профиля и биофизических свойств ионных каналов,

сформированных при участии аноктаминов.

Конкретное личное участие автора в получении результатов. Все результаты,

представленные в диссертации, получены при личном участии автора. Все работы,

касающиеся

экспрессии

аноктаминов

во

вкусовых

клетках,

клонирования

полноразмерных кДНК аноктаминов, конструирования рекомбинантных плазмид, синтеза

рибопроб, приготовления криосрезов, гибридизации in situ и иммуногистохимического

анализа, проводились лично автором. Данные о локализации рекомбинантных аналогов

2

аноктаминов в трансфецированных культуральных клетках были получены совместно с

сотрудником лаборатории молекулярной физиологии клетки ИБК РАН к.б.н. Рогачевской

О.А.

Данные

о

биофизических

свойствах

рекомбинантных

аноктаминов

в

гетерологической системе экспрессии были получены совместно с аспирантом ИБК РАН

Черкашиным

А.П.

Автор

выражает

особую

благодарность

инженеру

центра

коллективного пользования ИБК РАН Кучину А.В. за неоценимую помощь в получении

конфокальных изображений.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах и состоит

из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их

обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 167 ссылок.

Диссертация содержит 40 рисунков.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на XXVI Зимней молодѐжной

научной

школе

"Перспективные

направления

физико-химической

биологии

и

биотехнологии "(Москва, 2014); Международной конференции молодых

ученых

"Экспериментальная

и

теоретическая

биофизика

'14"

и

"Экспериментальная

и

теоретическая биофизика '15" (Пущино, 2014, 2015); 18-й и 19-й Международных

Пущинских школах-конференциях молодых ученых "Биология-наука ХХI века" (Пущино,

2014, 2015); Международном симпозиуме "Biological motility. New facts and hypothesis"

(Пущино, 2014); конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация" (Пущино,

2015); международной конференции Advanced Microscopy Meeting “Super-resolution in

different dimensions” (Москва, 2015); конференции “Внутриклеточная сигнализация,

транспорт и цитоскелет” Санкт-Петербург, 2015; международной конференции the 6th

EMBO Meeting “Advancing the life sciences” (Birmingham, 2015).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три статьи в рецензируемых

журналах и две статьи в сборниках научных статей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.

Экспрессия генов аноктаминов во вкусовых почках.

Рисунок 1. ОТ-ПЦР анализ десяти генов, составляющих семейство аноктаминов, во вкусовых

почках мыши. Фрагменты ожидаемого размера были амплифицированы для Ано1 (356 п.н.), Ано2

(365 п.н.), Ано7 (391 п.н.), Ано9 (287 п.н.) и Ано10 (330 п.н.). М, ДНК маркер 100 bp Ladder,

Fermentas.

3

Семейство генов аноктаминов (TMEM16) насчитывает 10 представителей. Мы

исследовали экспрессию генов этого семейства во вкусовой ткани мыши с помощью ОТ-

ПЦР анализа с ген-специфическими праймерами. В качестве матрицы использовали

тотальную РНК, выделенную из вкусовых почек желобоватого вкусового сосочка. Как

показал ОТ-ПЦР анализ (Рис.1) во вкусовой ткани мыши экспрессированы гены,

кодирующие Ано1, Ано2, Ано7, Ано9 и Ано10. Отметим, что среди сенсорных систем

подобный профиль экспрессии генов аноктаминов (за исключением Ано6) был ранее

найден в вомеронасальном органе мыши (Dibattista et al, 2012). Во вкусовой ткани

приматов с помощью широкомасштабного скрининга c применением микрочипов ранее

были обнаружены только транскрипты Ано7 (Moyer et al, 2009). Известно, что все

представители семейства аноктаминов, за исключением Анo1 и Анo2, выявленные нами

во вкусовой почке, имеют цитоплазматическую локализацию, а ионный канал должен

быть интегральным мембранным белком, как Ано1 и Ано2. В обзоре литературы описаны

противоречивые данные относительно канальных свойств Ано6, однако экспрессия этого

аноктамина во вкусовой почке не обнаружена. Далее наша работа была направлена на

клонирование полноразмерных кДНК Ано1 и Ано2 из вкусовых почек мыши.

2.

Клонирование полноразмерной кДНК Ано1.

В базе данных NCBI есть две последовательности мРНК Ано1, которые соответствуют

двум

транскрипт-вариантам

Ано1.

Это

NM_178642.5

и

NM_001242349.1.

Для

клонирования полноразмерной кДНК Ано1 были сконструированы ген-специфические

праймеры, узнающие оба транскрипт-варианта. ОТ-ПЦР амплификация длинных

последовательностей, размер которых превышает 3000 п.н., представляет определенные

трудности. Это связано с этапом обратной транскрипции (ревертазы могут не «прочитать»

до конца длинные последовательности), а также с очень низкой концентрацией РНК-

матрицы: в препаратах, выделенных из вкусовых почек, количество тотальной РНК

меньше 1 нг.

Рис.2. ОТ-ПЦР амплификация кДНК Ано1.

(А) ПЦР проведена с внешними праймера-

ми. Стрелка указывает на слабую полосу,

соответствующую фрагменту ожидаемого

размера 3117 п.н. (нуклеотиды 84-3200,

NM_178642.5), ДНК которого затем была

использована в nested ПЦР с внутренними

праймерами (Б). Фрагмент ожидаемого раз-

мера 3050 п.н, соответствующий нуклео-

тидам 99-3148M, клонирован в плазмиду

pQBI25-fN3. М, 1 kb Ladder, Fermentas.

А

Б

Полноразмерная кДНК Ано1 была получена в результате обратной транскрипции и двух

реакций ПЦР “с углублением” (nested PCR) с высоко точной ДНК полимеразой Phusion

(Рис. 2) и затем клонирована по сайтам HindIII и EcoRI в вектор pQBI25-fN3,

определяющий синтез в клетках млекопитающих целевого белка, слитого на С-конце с

4

зеленым

флуоресцентным

белком

Quantum’s

SuperGloTMGFP.

Ген-специфические

праймеры, используемые нами при клонировании, узнавали оба транскрипт-варианта

Ано1.

Первый

транскрипт-вариант

(NM_178642.5)

отличается

от

второго

(NM_001242349.1) добавочными 12 нуклеотидами в позициях 1608-1619 и отсутствием 3

нуклеотидов, которые есть у второго транскрипт-варианта в позициях 230-232. Поэтому

необходимо было выяснить, какой из этих транскрипт-вариантов мы клонировали из

вкусовых почек мыши. Для этого мы провели ПЦР-анализ плазмиды pQBI25-fN3/Ано1 с

транкрипт-специфическими праймерами, который показал, что были клонированы оба

транскрипт-варианта (Рис.3).

Рисунок

3.

Применение

транскрипт-специфических

праймеров в реакции ПЦР, для различения транскрипт-

вариантов 1 (NCBI, NM_178642.5) and 2 (NCBI,

M_001242349.1) в клонированной полноразмерной кДНК

Ано1. Первая пара праймеров амплифицирует фрагмент

ожидаемого размера 238 п.н. только с транскрипт-

варианта 1 (дорожка 1). Вторая пара праймеров

амплифицирует фрагмент ожидаемого размера 340 п.н.

только с транскрипт-варианта 2.

Присутствие обоих транскрипт-вариантов в клонированной кДНК Ано1 позволяет

исследовать в гетерологической системе экспрессии биофизические свойства канальных

белков в том составе, в котором они имеются в нативных вкусовых клетках мыши.

3.

Клонирование полноразмерной кДНК Ано2.

Ген Ано2 подвержен альтернативному сплайсингу в области 5’-конца и в области 14

экзона. Сплайс-варианты транскриптов Ано2 ранее были выявлены в обонятельном

Рис. 4. Схема

возможных вариантов

5’-конца кДНК Ано2 с

положением

транскрипт-

специфических

праймеров,

используемых для их

выявления.

эпителии (Stephan et al, 2013). Кроме канонического варианта в обонятельном эпителии

экспрессирован альтернативный вариант, в котором отсутствуют первые два экзона, и

старт инициации трансляции расположен в альтернативном экзоне 1b (Рис.4). Кроме того,

и в каноническом (изоформа А), и в альтернативном (изоформа В) варианте сплайсингу

могут

подвергается

4

и

14

экзоны.

Мы

исследовали

сплайс-варианты

Ано2,

5

представленные во вкусовых почках, с использованием ОТ-ПЦР и транскрипт-

специфических праймеров (Рис. 5). В результате были выявлены изоформа А и изоформа

В. Изоформа А представлена транскриптами с 4-ым и без 4-го экзона, изоформа В

представлена только транскриптом, содержащим 4-ый экзон. Кроме того, во вкусовой

почке были выявлены транскрипты с 14-ым и без 14-го экзона (Рис.6).

Рисунок 5. ОТ-ПЦР анализ экспрессии сплайс-вариантов Ано2 во вкусовых почках мыши.

Использовались пары праймеров, расположение которых показано на рис. 4: (1) F2/R1, ожидаемые

размеры фрагентов 541 и 442 п.н., (2) F3/R1, ожидаемые размеры фрагментов 678 и 579 п.н.; (3)

F1/R1, 627 и 528 п.н.; (4) F1/R2, 474 и 375 п.н., (5) F/R2, 683 и 584 п.н. М, 100 bp Ladder

(Fermentas).

Рисунок 6. ОТ-ПЦР анализ сплас-вариантов Ано2, представленных

во вкусовой почке с транскрипт-специфическими праймерами,

узнающими кДНК с 14 экзоном, 232 п.н. (дорожка1) и без него,

206 п.н. (дорожка 2).

Для

клонирования

полноразмерной

кДНК

Ано2

были

сконструированы

ген-

специфические праймеры на основе последовательности NM_153589.2 в базе данных

NCBI. Как и в случае с Ано1, при клонировании использовались две реакции ПЦР “с

углублением” (Рис. 7 и 8). Кроме того, при конструировании рекомбинантной плазмиды

pQBI25-fN3/Ано2 мы применили метод гомологической рекомбинации ПЦР фрагментов

in vivo. Акцепторный вектор pQBI25-fN3 амплифицировали в реакции ПЦР с праймерами,

несущими на 5’-концах последовательности, комплементарные концевым участкам

целевой кДНК, от вектора-матрицы после реакции ПЦР избавлялись с помощью

рестриктазы DpnI. Целевую кДНК амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР и праймеров,

несущих на 5’-концах адаптеры, комплементарные последовательности плазмиды (Рис. 8).

Рисунок 7. ОТ-ПЦР амплификация полноразмерной кДНК Ано2

(нуклеотиды 241-3349, NM_153589.2) с использованием тотальной РНК

вкусовой почки в качестве матрицы и различных температурных

режимов (дорожки 1-3). Получен фрагмент ожидаемого размера 3109

п.н., ДНК которого затем использовалась в качестве матрицы для nested

ПЦР с внутренними праймерами (Рис. 8, дорожка 1).

6

В результате были получены два ПЦР-фрагмента плазмиды и вставки, несущих на 5’-

концах гомологичные последовательности, которые опосредуют рекомбинацию между

линейными ПЦР продуктами in vivo в клетках E. сoli. Метод рекомбинации ПЦР

фрагментов in vivo оказался гораздо эффективнее для клонирования длинных фрагментов

ДНК по сравнению с методом конструкции рекомбинантных плазмид с применением

рестрикции-лигирования.

Рисунок 8. Получение ПЦР фрагментов плазмиды

pQBI25-fN3 и вставки (кДНК Ано2) для

гомологической рекомбинации in vivo. Дорожка 1,

ПЦР фрагмент Ано2 3051 п.н. (нуклеотиды 296-3310,

NM_153589.2) амплифицирован в ПЦР с внутренними

праймерами, несущими адапторные

последовательности, комплементарные

последовательности pQBI25-fN3. Дорожка 2, вектор

pQBI25-fN3 амплифицирован в ПЦР с праймерами,

несущими адаптерные последовательности,

комплементарные концевым частям фрагмента Ано2,

фрагмент 6231 п.н.

Использованные для клонирования ген-специфические праймеры способны узнавать

несколько сплайс-вариантов Ано2: с 4-ым экзоном и без него, а также с 14-ым экзоном и

без него. Поэтому мы применили ПЦР с транскрипт-специфическими праймерами для

анализа выделенных плазмид. Оказалось, что клонированная кДНК Ано2 не содержала

сплайс-варианта без 4 экзона (Рис. 9), но оба сплайс-варианта, затрагивающие область 14-

го экзона, в ней были представлены. Первоначальное секвенирование плазмиды pQBI25-

fN3/Ано2 показало наличие кДНК без 14 экзона. Однако ПЦР-анализ плазмиды с

транскрипт-специфическими праймерами выявил оба варианта – с 14 экзоном и без него.

Последующее секвенирование с использованием транскрипт-специфических праймеров

Рисунок 9. ПЦР-анализ плазмид pQBI25-fN3/Ано2, выделенных из 15 колоний первичных

трансформантов, с парой праймеров, позволяющих выявить канонический 5’-концевой вариант с

четвертым экзоном (540 п.н.) и сплайс-вариант без четвертого экзона (441 п.н.). Ни одна из 15

выделенных плазмид не содержала кДНК без четвертого экзона.

подтвердило, что мы клонировали оба варианта кДНК с 14 и без 14 экзона, и оба этих

варианта содержали 4 экзон. Эти результаты позволяют предположить, что

клонированной кДНК вариант без 14 экзона является преобладающим.

в

7

4.

Подтверждение функциональности рекомбинантных аналогов Ано1 и 2 в

гетерологической системе экспрессии.

Для доставки кДНК канальных белков Ано1 и Ано2 в клетки линии CHO (Chinese Hamster

Ovary) использовалась плазмида pQBI25-fN3 (Quantum Biotechnologies), которая

определяет синтез в трансфецированных клетках химерного белка, слитого на С-конце с

зеленым флуоресцентным белком.

Рисунок 10. Конфокальное изображение живых клеток

линии

CHO,

трансфецированных

вектором

pQBI25/Ano1, в проходящем свете и их флуоресценция

(530±15 нм) при возбуждении 488 нм.

Вектор pQBI25-fN3 отличается от известных цветных плазмид фирм Клонтех и Евроген

тем, что последовательность GFP в его составе не содержит старт-кодона. Когда мы

конструируем

гибридную

ДНК

в

составе

вектора

pQBI25-fN3,

целевая

последовательность должна содержать старт-кодон, не содержать стоп-кодона и должна

быть вставлена в плазмиду с сохранением открытой рамки считывания. Если эти

требования выполняются, то с рекомбинантной плазмиды будет синтезироваться в

трансфецированных клетках флуоресцентный химерный белок.

Рисунок 11. Конфокальное изображение живых клеток

линии

CHO,

трансфецированных

вектором

pQBI25/Ano2, в проходящем свете и их флуоресценция

(530±15 нм) при возбуждении 488 нм.

Наличие флуоресценции в трансфецированных клетках показывает, что целевая ДНК

вставлена в плазмиду с сохранением открытой рамки считывания. Теоретически, если

клонированная кДНК кодирует ионный канал, то химерный белок должен быть

локализован в цитоплазматической мембране трансфецированных клеток. Поэтому мы

провели исследование локализации рекомбинантных белков Ано1-GFP и Ано2-GFP в

трансфецированных клетках линии CHO с помощью конфокальной микроскопии.

8

Конфокальное сканирование выявило зеленую флуоресценцию, соответствующую

рекомбинантным белкам Ано1 и Ано2 в цитоплазматической мембране (Рис. 10, 11).

Локализация рекомбинантных белков Ано1-GFP и Ано2-GFP в цитоплазматической

мембране культуральных клеток линии CHO, трансфецированных сконструированными

плазмидами, является косвенным доказательством канальной природы этих белков.

Следующей задачей было доказать, что на основе клонированных из вкусовой ткани

комплементарных ДНК, кодирующих Ано1 и Ано2, были получены рекомбинантные

белки, обладающие способностью формировать функциональный канал.

Рисунок 12. Трансфекция клеток CHO плазмидой pQBI25/Ано1 индуцирует экспрессию Са2+-

активируемых анионных каналов. (A) Репрезентативный ответ Aнo1-положительной клетки,

поддерживаемой при потенциале -50 мВ, на аппликацию иономицина (5 мкМ). Регистрация

методом перфорированного пэтча. В регистрирующей пипетке 140 мМ CsCl, в экстраклеточном

растворе – 140 мМ NaCl. (B) Семейства интегральных токов, регистрируемых в Aно1-

положительной клетке в контроле (верхняя панель), после аппликации иономицина (средняя

панель) и после удаления ионофора. Для измерения токов клетка поляризовалась 500 мс

импульсами в пределах -100 мВ 80 мВ непосредственно перед добавлением иономицина (1), в

момент достижения пика входного тока (2) и после отмыва (3). (С) Вольт-амперные

характеристики интегральных токов, представленных в (В). Данные предоставлены А.

Черкашиным.

Исследование биофизических свойств рекомбинантных Ано1-GFP и Ано2-GFP в

гетерологической системе экспрессии проводилось с помощью метода пэтч-кламп и

ингибиторного анализа (Рис. 12 и 13). По сравнению с нетрансфецированными клетками

Ано1- и Ано2-положительные клетки CHO демонстрировали драматическое изменение

электрофизиологических характеристик при аппликации Са2+ ионофора иономицина (1-

5 мкМ), который инициировал увеличение внутриклеточного Са2+ до микромолярного

уровня. Иономицин вызывал быструю активацию входящего тока как в Aно1- (Рис.12А),

так и в Ано2-положительных клетках (Рис. 13А).

9

Рисунок 13. Трансфекция клеток CHO плазмидой pQBI25-Aнo2 индуцирует экспрессию Са2+-

активируемых анионных каналов. (A) Репрезентативный ответ Aнo2-положительной клетки,

поддерживаемой при потенциале -40 мВ, на аппликацию иономицина (5 мкМ). (B) Семейства

интегральных токов, регистрируемых в Aно1-положительной клетке в контроле (верхняя

панель), после аппликации иономицина (средняя панель) и после удаления ионофора. Для

измерения токов клетка поляризовалась 150 мс импульсами в пределах -100 мВ 80 мВ

непосредственно перед добавлением иономицина (1), в момент достижения пика входного тока

(2) и после отмыва (3).

(С) Вольт-амперные характеристики интегральных токов,

представленных в (В). Условия регистрации как на Рис.12. Данные предоставлены А.

Черкашиным.

В контроле до аппликации иономицина, интегральные токи и их почти линейная вольт-

амперная (I-V) характеристика в Ано1-положительных клетках были весьма сходны с

токами нетрансфецированных клеток (Рис.12 B, C, кривые 1). В присутствии иономицина

появлялись ПЗ токи с выраженной активационной кинетикой (Рис.12В, семейство токов

2). Интегральная проводимость клеток значительно возрастала, и ее I-V характеристика

становилась нелинейной (Рис.12С, кривая 2). Аналогичные результаты были получены на

Aнo2-положительных клеток (Рис.13). Электрофизиологические эксперименты указывают

на то, что гетерологическая экспрессия Ано1 и Ано2, клонированных из вкусовых клеток,

индуцирует появление хлорных каналов, активируемых внутриклеточным кальцием, на

плазматической мембране клеток CHO. Важно отметить, что нативные СаСС-каналы в

различных типах клеток могут формироваться не одним типом канальных белков, а

несколькими. Созданные нами плазмиды на основе кДНК, клонированных из вкусовой

ткани, кодируют несколько изоформ аноктаминов. Клонирование кДНК аноктаминов и

конструкция рекомбинантных плазмид для их гетерологической экспрессии является

первым этапом молекулярной идентификации СаСС-каналов, функционирующих во

вкусовых клетках. Следующим этапом молекулярной идентификации, для которого

потребуются

биофизические

исследования,

заключается

в

сравнении

свойств

рекомбинантных каналов и эндогенных каналов из вкусовых клеток. Если эти свойства

окажутся похожими, то молекулярная идентификация СаСС каналов может считаться

10

успешной. Если свойства будут отличаться, значит в формировании СаСС-каналов

вкусовых клеток, кроме аноктаминов, принимают участие какие-то еще канальные белки

и/или аксесорные молекулы.

5.

Локализация мРНК аноктаминов на срезах вкусовой ткани мыши.

Рисунок 14. In situ гибридизация DIG-

меченной антисмысловой (верхняя панель) и

смысловой (нижняя панель) рибопроб к Ано1

на срезах желобоватого сосочка языка мыши.

Рибопроба выявлялась с помощью анти-DIG

антител, меченных щелочной фосфатазой и

флуоресцентного субстрата Elf97. Зеленые

точки

соответствуют

молекулам

мРНК,

голубая

флуоресценция

соответствует

клеточным

ядрам,

окрашенным

Hoechst33342.

Рисунок 15. In situ гибридизация DIG-меченной

антисмысловой (левая панель) и

смысловой (правая панель) рибопроб к Ано2 на срезах желобоватого сосочка языка мыши.

Рибопроба выявлялась с помощью анти- DIG антител, меченных щелочной фосфатазой, и

красителя NBT/BCIP.

11

Мы использовали метод гибридизации рибопроб in situ для получения доказательств, что

мРНК аноктаминов Ано1 и Ано2 действительно локализована во вкусовой ткани. Мы

синтезировали смысловые и антисмысловые рибопробы к исследуемым аноктаминам с

использованием Sp6 и T7 РНК полимераз и метода in vitro транскрипции. Участки кДНК

аноктаминов были клонированы в векторы pAL-TA (Ано1) и pSPT19 (Ано2), содержащие

последовательности промоторов Sp6 и T7 РНК полимераз. Для синтеза смысловых и

антисмысловых рибопроб in vitro использовалась смесь рибонуклеотидов, в состав

которой входит меченный дигоксигенином UTP. Размер DIG-рибопроб составил 336 п.н.

для Ано1 и 1135 п.н. для Ано2. Мы использовали иммунологическую детекцию рибопроб,

связавшихся с молекулами мРНК на срезах, с помощью антител к дигоксигенину,

конъюгированных с щелочной фосфатазой (Roche). В случае Ано1 был использован

флуоресцентный субстрат щелочной фосфатазы Elf97 (Molecular Probes). Бурые точки

соответствуют молекулам мРНК. Точки зеленой флуоресценции, соответствующие

молекулам мРНК Ано1 были обнаружены в области вкусовых почек на гистологических

срезах желобоватого сосочка языка мыши (Рис. 14). Для выявления рибопроб к Ано2

использовался субстрат-хромофор NBT/BCIP (Roche). Бурые точки в области вкусовых

почек на срезе соответствовали молекулам мРНК Ано2 (Рис. 15). Отметим, что в случае

Ано1 интенсивность сигнала была сильнее, по сравнению с сигналом Ано2, однако,

возможно, это связано с большей чувствительностью флуоресцентного субстрата Elf97

(Molecular Probes) по сравнению с хромофорным субстратом (NBT/BCIP). Интенсивность

сигнала на срезах определяется множеством факторов, например, нуклеотидным составом

пробы и степенью деградации мРНК, которая имеет место после многочисленных

проводок во время фиксации ткани, приготовления срезов и иммунохимической детекции.

Еще большее значение имеют процесс проникновения пробы к целевой мРНК, которая

может быть замаскирована окружающими молекулами белков на срезе, а также

последующие проводки для отмывки не связавшейся пробы. Иногда на одном и том же

стекле встречались срезы с хорошим сигналом и совсем без него. Поэтому гибридизация

in situ показывает лишь место локализации целевой мРНК на гистологических срезах, но

не может применяться для количественной оценки.

6. Локализация Ано1 и Ано2 на срезах желобоватого вкусового сосочка мыши.

Локализация белков Ано1 и Ано2 на криосрезах желобоватого сосочка языка

исследовалась с помощью иммунофлуоресценции и иммуногистохимии. Поскольку в этих

экспериментах использовались коммерческие антитела, по существующей

традиции

необходимо подтвердить их специфичность, и именно этого от нас потребовали

рецензенты при публикации результатов работы в журнале. Для подтверждения

специфичности антител обычно используются срезы ткани, для которой уже установлена

локализация исследуемых антигенов, и эти эксперименты служат положительным

контролем метода. Для выполнения положительного контроля мы использовали срезы

обонятельного эпителия OMP-GFP мышей, у которых ген зеленого флуоресцентного

белка экспрессируется под контролем промотора специфического маркера зрелых

обонятельных нейронов ОМР. Все дифференцированные обонятельные нейроны,

12

установившие контакт с обонятельной луковицей, у OMP-GFP мышей обладают зеленой

флуоресценцией.

Обонятельный эпителий является псевдо-многорядным эпителием, состоящим из трех

основных клеточных типов: базальные клетки, опорные клетки и обонятельные нейроны.

Ядра этих клеток лежат на разных уровнях. Нижний ряд составляют ядра базальных

клеток, ядра опорных клеток находятся ближе всего к поверхности обонятельного

эпителия, а посередине находятся ядра обонятельных нейронов. Схема строения

обонятельного эпителия, применительно к полученным нами срезам, предоставлена на

рисунке 16. На конфокальных изображениях гистологических срезов OMP-GFP мышей

(рис.16) очень хорошо просматривается биполярная морфология обонятельных нейронов,

включая тела нейронов, дендриты и обонятельные булавы, представленные отдельными

зелеными точками на поверхности обонятельного эпителия. По данным литературы

известно, что Ано2 располагается в области тончайших цилий (Dibattista et al, 2012;

Dauner et al, 2012), которые отходят от булав. Топографически эта область находится на

поверхности эпителия, на границе с обонятельными булавами и чуть повыше них.

На

рис.

17В

мы

видим

интенсивную

красную

иммунофлуоресценции

Ано2,

покрывающую сверху сплошной широкой полосой зеленые обонятельные булавы

дендритов. Такой паттерн соответствует цилиарной области обонятельного эпителия

(Dibattista et al, 2012; Dauner et al, 2012). Относительно локализации Ано1 в обонятельном

эпителии имеются несколько противоречивые данные. В 2012 были опубликованы сразу

две статьи, в которых исследовалась локализация Ано1 и Ано2 в этой ткани (Dauner et al,

2012; Dibattista et al, 2012). В первой статье Dauner с соавторами предоставили

убедительные доказательства локализации Ано1 в микровиллярной области поверхности

эпителия, а во второй (Dibattista et al, 2012) - Ано1 на поверхности обонятельного

эпителия не был обнаружен.

С помощью конфокальной микроскопии срезов обонятельного эпителия OMP-GFP мышей

(Рис. 17А), обработанных анти-Ано1 антителами (Alomone) и вторичными антителами,

мы обнаружили не широкую полосу, а отдельные красные точки иммунофлуоресценции,

соответствующей Ано1. Точки располагаются в поверхностном слое обонятельного

эпителия на уровне с зелеными обонятельными булавами и чуть пониже их, что

топографически соответствует микровиллярной области. Таким образом, мы подтвердили

специфичность используемых коммерческих антител к Ано1 и Ано2, а также получили

данные, позволяющие разрешить противоречие результатов о локализации Ано1 в

обонятельном эпителии в пользу Dauner с соавторами (2012). Антитела затем

применялись для изучения локализации аноктаминов на срезах желобоватого вкусового

сосочка языка мыши.

13

Рисунок 16. Схема строения и конфокальное изображение среза обонятельного эпителия OMP-

GFP мыши. Ядра клеток (синяя флуоресценция) прокрашены Hoechst. Зеленая флуоресценция

соответствует обонятельным нейронам.

Рисунок 17. Иммунофлуоресценция Ано1 (А) и Ано2 (В) на срезах обонятельного эпителия OMP-

GFP мышей. Криосрезы были обработаны антителами кролика против Ано1 (А) и Ано2 (В), а

затем

вторичными

антителами,

конъюгированными

с

Alexa

Fluor

647.

Красная

иммунофлуоресценция

показывает

локализацию

аноктаминов,

зеленая

флуоресценция

соответствует обонятельным нейронам. Стрелки указывают на обонятельные булавы дендритов.

Периферическим органом вкуса является вкусовая почка. Вкусовые почки имеют вид

микроскопических телец эллипсоидной формы, расположенных в толще многослойного

эпителия сосочков языка. Каждая вкусовая почка состоит из вытянутых вкусовых клеток,

прилежащих друг к другу наподобие долек. На вершине вкусовой почки имеется

небольшая ямка, на дне которой открывается так называемая вкусовая пора.

Морфологически больше всего почек содержится в желобоватом сосочке, и он больше по

размеру по сравнению с остальными вкусовыми сосочками. Тем не менее, из-за

микроскопических размеров изолированную и фиксированную вкусовую ткань очень

сложно правильно ориентировать при приготовлении срезов так, чтобы срез прошел вдоль

14

сосочка, и были видны круглые вкусовые почки, расположенные с двух сторон от разъема

сосочка. При разработке протокола приготовления срезов оказалось, что решающее

значение имеет не только качество коммерческих антител, но, прежде всего, технические

тонкости, связанные с вариациями времени фиксации ткани, демаскировкой антигенов,

подборкой

фиксирующего

агента

и

блокирующего

раствора,

способствующего

максимальному устранению неспецифической флуоресценции. На рис.18 показаны

результаты конфокальной микроскопии срезов вкусового сосочка, обработанного

специфическими антителами к Ано1, а затем вторичными антителами. Красная

иммунофлуоресценция специфически локализована в отдельных клетках, хорошо

просматривается вытянутая форма вкусовых клеток, только единичные клетки во

вкусовых почках обладают флуоресценцией. Решающее значение при приготовлении

срезов имеет ориентация ткани при нарезке, от ориентации зависит, попадет ли на срез

области, содержащие отверстия вкусовой поры. На тех срезах, где вкусовые поры есть в

поле зрения, особенно интенсивная иммунофлуоресценция Ано1 сконцентрирована как

раз в области отверстия вкусовых пор. Фотографии двух таких срезов со специфической

локализацией иммунофлуоресценции Ано1 в области вкусовой поры показаны на рисунке

19. Картина иммунофлуоресценции Ано2 во вкусовом сосочке отличается от Ано1

(рис.20). Не выявлена локализации Ано2 в области вкусовой поры, отдельные вкусовые

клетки явно не окрашивались. Мы наблюдаем равномерное диффузное распределение

красной иммунофлуоресценции, соответствующей Ано2, по всей поверхности почек на

срезе вкусового сосочка языка мыши (Рис.20). Отметим, что в обонятельном эпителии

были противоположные результаты: яркая широкая полоса иммунофлуоресценции Ано2 и

отдельные точки со слабой интенсивностью сигнала, соответствующего Ано1 (Рис. 17).

Аналогичную картину иммуно-окрашивания Ано2 на срезе вкусового сосочка мыши мы

получили при использовании вторичных антител, конъюгированных с щелочной

фосфатазой и хромофорного субстрата для щелочной фосфатазы NBT/BCIP (рис. 21).

Таким образом, мы получили доказательства специфической локализации Ано1 и Ано2 во

вкусовых почках в желобоватом вкусовом сосочке языка мыши на уровне мРНК и белка.

7.

Экспрессионный анализ одиночных клеток.

Для нас было важно не просто предоставить доказательства, что Ано1 и Ано2

локализованы во вкусовых почках на уровне мРНК и белка, но и выяснить, в клетках

какого типа они находятся. Это было сделано с помощью экспрессионного анализа

индивидуальных вкусовых клеток. До недавнего времени, индивидуальные клетки можно

было изучать только на функциональном уровне с использованием методов микроскопии,

микрофотометрии и электрофизиологии. Разработка высокочувствительных технологий

экспрессионного анализа расширила экспериментальные возможности, сделав реальным

исследование молекулярного фенотипа одиночных клеток. Считается, что типичные

клетки содержат в среднем 10-20 pg тотальной РНК, из которой на долю мРНК

приходится не более 5%, что соответствует лишь фемтограммам транскриптов мРНК

индивидуальных генов. В конце прошлого века для анализа профиля экспрессии генов в

образцах, содержащих ничтожно малые количества мРНК, были разработаны методы

глобальной амплификации РНК (Belyavsky et al., 1989; Brady et al., 1990; Van-Gelder et al.,

1990; Eberwine et al., 1992).

15

Рисунок 18.

Иммунофлуоресценция

Ано1 (А) на срезах

вкусового сосочка языка

мыши. Криосрезы были

обработаны антителами

кролика против Ано1 (А)

или нормальной сывороткой

кролика (В), а затем

вторичными антителами,

конъюгированными с Alexa

Fluor 647.

Рисунок 19.

Иммунофлуоресценция

Ано1 в области отверстий

вкусовых пор,

расположенных на

апикальном конце почек на

двух срезах желобоватого

сосочка языка мыши.

Рисунок 20.

Иммунофлуоресценция

Ано2 (А) на срезах

вкусового сосочка языка

мыши. Криосрезы были

обработаны антителами

кролика против Ано2 (А)

или нормальной сывороткой

кролика (В), а затем

вторичными антителами,

конъюгированными с Alexa

Fluor 647.

Рисунок 21. Иммуногистохимический анализ

локализации Ано2 на криосрезах желобоватого

сосочка языка мыши. А-инкубация с анти-Ано1

антителами, вторичными антителами, меченными

щелочной фосфатазой и субстратом-красителем

NBT/BCIP;

Б-контроль,

первичные

антитела

заменены на нормальную сыворотку кролика. 1,

разъем вкусового сосочка; 2, почки.

16

Мы изучали профиль экспрессии генов в одиночных вкусовых клетках с использованием

технологии линейной амплификации антисмысловых РНК (аРНК), получившей название

“метод Эбервайна” (Eberwine et al., 1992, Van-Gelder et al., 1990). Популяция клеток

вкусовой почки включает три типа, которые отличаются по ультраструктурным

особенностям, функциональным свойствам и по экспрессии маркерных белков,

специфических для каждого типа. Специфическим клеточным маркером клеток типа I

считаются нуклеотид-трифосфат-дифосфогидролаза 2 (NTPDase2) (Bartel et al., 2006).

Практически все клетки типа II содержат фосфолипазу С бета-2, ключевую сигнальную

молекулу каскада вкусовой трансдукции (Chaudhari et al., 2010). Маркером клеток типа III

считается канальная субъединица PKD2L1 (DeFazio et al., 2006; Kataoka et al., 2008). При

проведении

экспрессионного

анализа

каждая

клетка,

изолированная

из

почек

желобоватого вкусового сосочка, затягивались в стеклянный микроэлектрод, помещалась

в ПЦР-пробирку с раствором для синтеза первой цепи кДНК и немедленно

замораживалась при -80οС.

Рисунок 22.

Ко-экспрессия

генов

аноктаминов

с

клеточными маркерами и бета-актином в

одиночных

вкусовых

клетках,

изолированных из желобоватого вкусового

сосочка. В качестве матрицы в ПЦР с ген-

специфическими

праймерами

использовалась кДНК одиночной клетки,

линейно амплифицированная по методу

Эбервайна. Транскрипты Ано1 обнаружены

в 3 клетках типа II (n=15), транскрипты

Ано2 обнаружены в 2 клетках типа I (n=20)

и 2 клетках типа II (n=15); клетки типа III

(n=8),

не

содержали

транскриптов

аноктаминов.

Рисунок 23. Флуоресцентное изображение

дифференцированных обонятельных нейронов,

изолированных из обонятельного эпителия OMP-GFP

мышей.

Чтобы избежать потерь, РНК из одиночных клеток не выделялась, обратная транскрипция

проводилась на клеточном лизате. Лизис клетки достигался за счет замораживания-

нагревания до 65οС. Для обратной транскрипции использовался “праймер Эбервайна”:

17

м

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17

750

500

750

500

Рисунок 24. Межклеточные вариации в уровне экспрессии гена домашнего хозяйства бета-актина

в одиночных обонятельных нейронах, находящихся на одной стадии дифференцировки.

Гибрид РНК-кДНК обрабатывался РНКазой Н, затем синтезировалась вторая цепь кДНК.

Полученные молекулы двухцепочечной ДНК содержат последовательность промотера

РНК полимеразы фага Т7 и, следовательно, могут быть использованы в качестве матрицы

для транскрипции in vitro аРНК с помощью Т7 РНК полимеразы. Амплифицированная

аРНК обрабатывается ДНКазой I, для удаления не только синтезированной кДНК, но и

геномной ДНК, и затем используется в качестве матрицы для проведения реакции

обратной транскрипции со случайными праймерами-гексамерами. Полученная кДНК

затем используется как матрица в реакции ПЦР с ген-специфическими праймерами. В

каждой клетке мы определяли профиль экспрессии трех маркеров клеточного типа

(NTPDase2, plcb-2, PKD2L1), а также бета-актина и двух аноктаминов. Из 15 клеток типа I,

экспрессирующих NTPD2, в двух были обнаружены транскрипты Ано2. Из 20 клеток II

типа, экспрессирующих PLCβ2, в трех были выявлены транскрипты Ано1 и в двух -

транскрипты Ано2. Всего восемь изолированных клеток содержали транскрипты PKD2L1,

что позволяло отнести их к типу III, и в них транскрипты аноктаминов найдены не были

(Рис 22). Отметим, что по результатам электрофизиологических исследований клетки типа

III не генерировали Са2+ - зависимых анионных токов (Cherkashin et al, 2015). При анализе

одиночных

клеток

мы

обнаружили,

что

интенсивность

ОТ-ПЦР-сигнала,

соответствующего бета-актину, варьировала (Рис. 22). Вариации наблюдались также и в

уровне экспрессии генов маркерных белков, который при усредненных измерениях,

выполненных на препаратах вкусовой ткани, стабилен и высок. Одной их причин

выявленной вариабельности является то, что анализируемые клетки, возможно, были

разного размера, или находились на разных стадиях клеточного цикла. Как известно,

вкусовые клетки постоянно дифференцируются из прогениторных клеток вкусовой почки,

и время их жизни в среднем составляет 2 недели. Поэтому интересным представлялось

оценить уровень экспрессии гена домашнего хозяйства в клетках, находящихся на одной

стадии дифференцировки. Такими клетками являются зрелые обонятельные нейроны. Мы

выделяли обонятельные нейроны из обонятельного эпителия трансгенных OMP-GFP

мышей. У OMP-GFP трансгенов только зрелые нейроны, в которых запущена экспрессия

генов обонятельных рецепторов, и аксоны которых установили контакт с обонятельной

луковицей, обладают зеленой флуоресценцией. По флуоресценции их можно отличить от

незрелых нейронов и других клеточных типов, представленных в обонятельном эпителии.

При усредненных измерениях в качестве референсного чаще всего используется бета-

актин.

В препаратах РНК, выделенной из различных тканей и клеточных линий, уровень

экспрессии бета-актина одинаков, стабилен и высок. Однако мы видим существенные

межклеточные вариации в содержании мРНК транскриптов бета-актина в обонятельных

18

модифицированный олиго(дТ)-нуклеотид, содержащий

на 5’- конце адаптерную

последовательность промотора РНК полимеразы фага Т7.

м

нейронах, находящихся на одной стадии клеточного цикла (Рис. 24). В чем может быть

причина выявленных нами межклеточных вариаций? Мы можем высказать следующее

предположение. В настоящее время установлено, что в процессе экспрессии генов

присутствуют элементы случайных флуктуаций, в результате чего синтез мРНК

индивидуальных генов в клетке происходит в виде кратковременных вспышек,

чередующихся с периодами релаксации (Elowitz et al 2002, Kumar 2015; Zoller, 2015;

Boeger et al, 2015). Основная причина заключается в том, что биохимические реакции,

лежащие в основе транскрипции и трансляции, протекают при участии небольшого числа

молекул,

а

процессы,

вовлекающие

единичные

молекулы,

неизбежно

носят

стохастический характер (Sato et al, 2003, Samoilov, 2006). Применение стратегии

глобальной амплификации РНК позволяет детектировать многочисленные мРНК

транскрипты, присутствующие в клетке в момент клеточного лизиса. Получаемая

статическая картина является как бы мгновенным «снимком» мРНК транскриптов,

находящихся в клетке в этот момент. Конечный результат экспрессионного анализа

определяется тем, когда произошел клеточный лизис – в момент вспышки транскрипции

или в период релаксации. В этом состоит основное ограничение современных методов

экспрессионного анализа - они не позволяют изучить динамику транскриптома одиночной

клетки. Мы детектируем межклеточные вариации в уровне экспрессии бета-актина во

вкусовых клетках и в обонятельных нейронах, а также межклеточные вариации в уровне

маркеров вкусовых

клеток,

которые при

усредненных

измерениях

показывают

неизменный уровень экспрессии. Можно предположить, что, если в момент клеточного

лизиса произошла вспышка транскрипции, то мы получим сильный ОТ-ПЦР-сигнал для

мРНК данного гена. Если момент лизиса совпадает с периодом релаксации, то сигнал

будет значительно слабее. Чем ближе к следующей вспышке транскрипции произведен

клеточный лизис, тем слабее будет сигнал. Принимая во внимание стохастический

характер вспышек экспрессии, между моментами вспышек и периодами релаксации

синтеза мРНК индивидуальных генов в клетке не может быть синхронизации.

Следовательно, относительное содержание мРНК транскриптов индивидуальных генов

постоянно меняется. Таким образом, выявленные нами межклеточные вариации могут

быть отражением динамичности транскриптома одиночной клетки. Может ли вообще

быть какой-либо внутренний контроль, обладающий неизменностью при проведении

экспрессионного анализа на уровне одиночной клетки? При усредненных измерениях

бета-актин служит референсным геном, поскольку уровень его экспрессии одинаков во

многих клеточных типах и тканях и не подвержен изменениям при изменяющихся

условиях. Однако на уровне одиночных клеток мы детектируем вариабельность. Нужно

отметить, что при анализе результатов экспрессионного анализа одиночных клеток в

настоящее время используют те же принципы интерпретации, которые приняты при

анализе усредненных измерений, сделанных на многочисленных клетках, при этом не

учитывается динамичный характер

клеточного транскриптома. С точки зрения

стандартной интерпретации, принятой при усредненных измерениях, источником

выявленных межклеточных вариаций в уровне экспрессии бета-актина может быть

разный размер клеток и, соответственно, различное количество тотальной РНК. При такой

стандартной интерпретации наших результатов бета-актин по-прежнему может служить

референсным геном при анализе каждой индивидуальной клетки. Однако, если принять во

внимание современные представления о дискретном характере процесса экспрессии

19

генов, то наши результаты можно интерпретировать как непостоянство уровня экспрессии

бета-актина на фоне динамичного клеточного транскриптома. При такой интерпретации

бета-актин не может быть референсным или служить в качестве внутреннего контроля,

обладающего неизменностью, при экспрессионном анализе одиночных клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Данная работа представляет собой первый шаг в направлении молекулярной

идентификации кальций-управляемых хлорных каналов, функционирующих во вкусовых

клетках мыши. Что подразумевается под молекулярной идентификацией, когда речь идет

об ионных каналах? Первоначальное открытие того или иного ионного канала обычно

происходит с использованием методов электрофизиологии и ингибиторного анализа. За

биофизическими исследованиями следует молекулярная идентификация белков, которые

формируют исследуемый канал. Молекулярная идентификация включает следующие

этапы: (1) проводится поиск белков-кандидатов на роль исследуемого канала; (2) с

помощью экспрессионного анализа получают подтверждение, какой из кандидатов

локализован в исследуемой ткани; (3) клонируется кДНК, кодирующая белок-кандидат на

роль канала, и затем клонированная кДНК экспрессируется в гетерологической системе;

(4) исследуются биофизические свойства канала, образованного рекомбинантным белком

в гетерологической системе экспрессии, а затем сравниваются свойства рекомбинантного

и нативного каналов. Если биофизические свойства рекомбинантного и эндогенного

каналов совпадают, то исследуемый белок действительно отвечает за канальную

активность, и молекулярная природа канала может считаться установленной. Разрыв

между функциональной и молекулярной идентификацией может занимать длительное

время. Электрофизиологические доказательства существования во вкусовых клетках

СаСС-каналов были получены 15 лет назад (Kim et al, 2001). Следуя описанному выше

алгоритму молекулярной идентификации, в данной работе мы впервые получили

доказательства, что Ано1 и Ано2 экспрессируются во вкусовых клетках на уровне мРНК и

на уровне белка и могут отвечать в них за Са2+-активируемый хлорный ток.

ВЫВОДЫ

1. Экспрессионный анализ генов семейства аноктаминов выявил мРНК транскрипты

аноктаминов 1, 2, 7, 9 и 10 в препарате РНК, выделенной из вкусовых почек желобоватого

вкусового сосочка языка мыши.

2. Из вкусовых почек мыши клонированы полноразмерные кДНК генов Ано1 и Ано2.

Сконструированы плазмиды pQBI25/Aнo1 и pQBI25/Aнo2, запускающие синтез в клетках

млекопитающих

рекомбинантных

аналогов

аноктаминов,

слитых

с

зеленым

флуоресцентным белком.

3. Функциональность полученных генно-инженерных конструкций подтверждена при

трансфекции клеток линии CHO. Гетерологическая экспрессия Aнo1-EGFP и Aнo2-EGFP

индуцирует появление зеленой флуоресценции на плазматической мембране клеток,

20

строго коррелирующей с существенным увеличением ионной проницаемости мембраны в

форме Са2+-зависимой хлорной проводимости.

4. Гибридизация in situ смысловых и антисмысловых рибопроб выявила локализацию

транскриптов мРНК аноктаминов 1 и 2 во вкусовых почках на криосрезах желобоватого

сосочка языка мыши.

5. Получены доказательства специфической локализации Ано1 и Ано2 во вкусовых

почках

желобоватого

сосочка

языка

мыши

с

помощью

иммуногистохимии

и

иммунофлуоресцентного анализа.

6. Распределение транскриптов Ано1 и Ано2 среди вкусовых клеток типов I, II и III,

изолированных из вкусовой почки мыши, исследовано с помощью метода глобальной

амплификации РНК одиночной клетки и последующего экспрессионного анализа. Во

вкусовых клетках типа I детектируются только транскрипты Ano2. В клетках типа II

детектируются транскрипты как Ano1, так и Ano2, но в разных, непересекающихся

субпопуляциях. Клетки типа III не экспрессируют Ano1 и Ano2.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. A. Cherkashin, A. Kolesnikova, M. Tarasov, R. Romanov, O. Rogachevskaya, M. Bystrova,

S. Kolesnikov. Expression of calcium activated chloride channels in mouse taste cells. Pflugers

archive-European Journal of Physiology, 2015 DOI 10.1007/s00424-015-1751-z

2. М. Ф. Быстрова, А. С. Колесникова, С. С. Колесников. Одиночная клетка: от

физиологии к анализу транскриптома // Успехи физиологических наук, 2013, том 44, № 1,

с. 3-16.

3. A. S. Kolesnikova, A. A. Khokhlov, R. R. Romanov, M. F. Bystrova. Differential expression

patterns of peroxiredoxins in olfactory neurons // Биологические мембраны, 2014, том 31, №

4, с.1–8.

4. A. Kolesnikova, A. Cherkashin, A. Khokhlov, M. Bystrova. Validation of beta-actin as a

reference gene in single-cell gene expression analysis // Статья в сборнике «Biological motility:

new facts and hypotheses», 2014, c. 116-120.

5. Колесникова А. С., Быстрова М. Ф. Иммуногистохимический анализ локализации

аноктаминов в обонятельном эпителии мыши // Статья в сборнике «Рецепторы и

внутриклеточная сигнализация», 2015, том 2, с. 19-23.

Тезисы

1.

Колесникова А.С., Тарасов М.В., Черкашин А.П., Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф.

Молекулярная идентификация Са2+- управляемого хлорного канала вкусовых клеток.

Сборник трудов XXVI Зимней молодѐжной научной школы "Перспективные направления

физико-химической биологии и биотехнологии", с. 109, 2014.

2.

Колесникова А.С., Тарасов М.В., Черкашин А.П., Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф.

Исследование хлорного канала вкусовых клеток мыши. Сборник тезисов докладов 18-й

Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология-наука ХХI

века", с. 257, 2014.

3.

Черкашин А.П., Колесникова А.С. Канальный белок, кодируемый геном АНО2,

может

формировать

Са-активируемый

хлорный

канал

во

вкусовых

клетках

21

млекопитающих. Сборник тезисов Международной конференции молодых ученых

"Экспериментальная и теоретическая биофизика '14", с. 132, 2014.

4.

A. Kolesnikova, E. Budanova, A. Kuchin, M. Bystrova. Immunohistochemical detection

of peroxiredoxin distribution among cells of mouse olfactory epithelium.// тезисы конференции

Advanced Microscopy Meeting “Super-resolution in different dimensions”, 2015, page 36.

5.

Черкашин А.П., Колесникова А.С., Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф. Исследование

Са2+-активируемых хлорных каналов Ано1 и Ано2 в гетерологической системе. Сборник

тезисов докладов 19-й Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых

"Биология-наука ХХI века", с. 381, 2015.

6.

Колесникова А. С., Быстрова М.Ф. Локализация аноктамина-1 в обонятельном

эпителии мыши. Сборник тезисов докладов 19-й Международная Пущинская школа-

конференция молодых ученых "Биология-наука ХХI века", с. 334, 2015.

7.

Колесникова А.С. Локализация аноктаминов в желобоватом вкусовом сосочке

мыши.

Сборник

тезисов

Международной

конференции

молодых

ученых

"Экспериментальная и теоретическая биофизика '15", с. 82, Пущино, 2015.

8.

Черкашин А.П., Колесникова А.С., Фадеев П.Ю., Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф.

Идентификация Са2+-активируемых хлорных каналов во вкусовых клетках. Сборник

тезисов

Международной

конференции

молодых

ученых

"Экспериментальная

и

теоретическая биофизика '15", с.119-120, Пущино, 2015.

9.

А. Kolesnikova, A. Khokhlov, R. Romanov, M. Bystrova. Stochastic dynamics of gene

expression may underlie variability of expression patterns detected at the single-cell level. The

EMBO Meeting 2015 “Advancing the life sciences”, Birmingham, 2015. Abstract book, page

123, Birmingham 2015.

10.

А. Колесникова, М. Быстрова. Исследование аноктаминов обонятельного эпителия

мыши. Цитология, т.57, N9, с.634. «Внутриклеточная сигнализация, транспорт,

цитоскелет», Санкт-Петербург, 2015.

22



Похожие работы:

«НИКУЛИНА Ольга Юрьевна БАБЕЗИОЗ СОБАК В РЯЗАНСКОЙ ОБЛАСТИ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ОСОБЕННОСТИ ЭПИЗООТОЛОГИИ, ЛЕЧЕНИЕ) Специальность: 03.02.11 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва 2016 Ведущая организация: аграрный университет. ФГБОУ ВО Ставропольский государственный Защита диссертации состоится 10 февраля 2016 г. в 14:30 ч на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на...»

«Антипов Владислав Анатольевич ПРИНЦИПЫ ПОСТРОЕНИЯ И ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ПЕСНИ ВОСТОЧНОГО СОЛОВЬЯ (Luscinia luscinia L., 1758) 03.02.04 зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2015 2 Работа выполнена на кафедре зоологии позвоночных биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова. Научный руководитель: доктор биологических наук, Иваницкий Владимир Викторович...»

«ЖАВОРОНКОВА Надежда Викторовна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАРАЗИТОФАУНЫ РЫБ В ВОДОЕМАХ РЯЗАНСКОЙ ОБЛАСТИ Специальности: 03.02.11 – паразитология 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2016 Работа выполнена на кафедре зоотехнии и биологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А....»





 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.