авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

На правах рукописи

Ким Екатерина Романовна

YB-1, процессированный 20S протеасомой, защищает клетку от ДНК-

повреждающих препаратов, участвуя в репарации ДНК

03.00.03 – Молекулярная биология

Автореферат диссертации

на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Пущ ино – 2015

цитоплазматического

клеточного контекста.

распределения в клетке, а такж е от уникального

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Y-бокс-связы вающ ий белок 1 (YB-1) – э то

многофункциональны й ядерно-цитоплазматический белок млекопитающ их,

содерж ащ ий э волюционно консервативны й домен холодового ш ока. YB-1

обладает способностью связы вать РНК и Д НК, а такж е взаимодействовать со

многими белками. Ф ункции YB-1 в клетке удивительно разнообразны. Как

Д НК-связы вающ ий белок он принимает участие в регуляции транскрипции

многих генов и в репарации Д НК (Eliseeva et al., 2011; Dolfini and Mantovani,

2013; Das et al., 2007). Как РНК-связы вающ ий белок YB-1 образует

комплексы с мРНК в момент синтеза и сопровож дает её на всех стадиях

созревания и функционирования (Sommerville et al., 1993; Soop et al., 2003).

В ядре белок направляет альтернативны й сплайсинг некоторы х пре-мРНК, а

в цитоплазме упаковы вает мРНК в мРНП и регулирует её стабильность и

активность в трансляции (Hartmuth et al., 2002; Evdokimova et al., 2001;

Evdokimova et al., 2006; Ovchinnikov et al., 2001; Deckert et al., 2006).

Конкретны е функции белка сильно зависят от его количества и ядерно-

YB-1 играет особую роль в формировании и развитии злокачественны х

опухолей различного происхож дения (Lasham et al., 2013; Matsumoto and

Bay, 2005; Eliseeva et al., 2011; Inoue et al., 2012). Количество YB-1 часто

бы вает повы ш ено при раке, кроме того, нередко наблюдается ядерная

локализация белка в опухолях. YB-1 вовлечён в процессы злокачественного

перерож дения клеток и их пролиферации, а такж е метастазирования

опухолей. Кроме того, он является фактором устойчивости раковы х клеток к

действию противоопухолевы х препаратов (Inoue et al., 2012). С читается, что,

действуя в ядре, YB-1 защ ищ ает клетки от лекарств, стимулируя

транскрипцию генов белков множ ественной лекарственной устойчивости

(MDR1 и MVP) и/или участвуя в репарации повреж дений Д НК (Kuwano et

al., 2003; Kuwano et al., 2004; Inoue et al., 2012).

3

биологическое

протеасомой.

значение

протеолитического

процессинга

YB-1

20S

Д ля

достиж ения

э той

цели

нуж но

бы ло

реш ить следующ ие

э кспериментальны е

задачи:

1)

более

детально

изучить

механизм

расщ епления

YB-1 20S протеасомой in vitro (определить участок YB-1,

отвечающ ий

за

связы вание

с

протеасомой,

детализировать

модель

э ндопротеолиза); 2) получить мутантную

форму YB-1, устойчивую

к

процессингу 20S протеасомой; 3) получить линии фибробластов NIH3T3,

стабильно трансфецированны е конструкциями для синтеза полноразмерного

HA-YB-1 и HA-YB-1 (1–219), и изучить последствия оверэ кспрессии э тих

белков.

Научная новизна и научно-практическое значение работы. В

данной работе впервы е показано наличие ранее неизвестного сайта

расщ епления

YB-1

20S

протеасомой

пептидной

связи

меж ду

4

Ранее в группе регуляции биосинтеза белка Института белка РАН бы ло

показано, что YB-1 мож ет подвергаться ограниченному убиквитин- и АТФ -

независимому протеолизу 20S протеасомой in vitro и in vivo при обработке

клеток Д НК-повреж дающ ими препаратами (Sorokin et al., 2005). Бы л

установлен сайт расщ епления – пептидная связь меж ду аминокислотны ми

остатками E219 и G220. Процессинг YB-1 оказы вает влияние на его ядерно-

цитоплазматическое распределение: N-концевой фрагмент белка, в отличие

от полноразмерного YB-1, обнаруж ивается в ядрах клеток. C-концевой

фрагмент белка, по всей видимости, полностью расщ епляется и не

обнаруж ивается в клеточны х лизатах. Бы ло установлено, что накопление N-

концевого фрагмента в ядрах клеток ассоциировано с восстановлением их

роста в присутствии Д НК-повреж дающ его препарата доксорубицина.

О днако механизм действия укороченного YB-1 не бы л установлен. В свете

важ ности данного белка для множ ества клеточны х процессов исследование

функций укороченной формы YB-1 представляет больш ой научны й интерес.

Цель и задачи исследования. Ц елью данной работы бы ло установить

аминокислотны ми остатками E216 и V217. Установлено, что замены

отрицательно заряж енны х E216 и E219 на полож ительно заряж енны е или

нейтральны е аминокислотны е остатки приводят к устойчивости YB-1 к

расщ еплению 20S протеасомой. Получена устойчивая к расщ еплению

мутантная форма YB-1. Получены линии фибробластов NIH3T3, стабильно

э кспрессирующ ие

HA-YB-1

и

HA-YB-1

(1-219)

под

контролем

индуцибельного промотора, последняя линия получена впервы е. Показано,

что оверэ кспрессия полноразмерного или укороченного YB-1 в клетках

NIH3T3 не влияет на скорость их пролиферации, но защ ищ ает от действия

Д НК-повреж дающ его агента доксорубицина. Установлено, что при вы соких

дозах

доксорубицина

укороченны й

белок

действует

э ффективнее

полноразмерного и что только расщ епляемы е формы YB-1 защ ищ ают клетки

от доксорубицина. В

данной работе впервы е продемонстрировано, что

протеолитический процессинг YB-1 под действием 20S протеасомы является

достаточны м условием для перехода белка в ядро клетки, где он входит в

состав Д НК-репарационны х комплексов и, вероятно, таким образом

защ ищ ает клетки от действия Д НК-повреж дающ их агентов.

Полученны е при вы полнении данной диссертационной работы

результаты вносят вклад в понимание механизма устойчивости клеток к

Д НК-повреж дающ им препаратам. О ни расш иряют и углубляют понимание

роли белка YB-1 в э том процессе. Полученны е данны е указы вают на

важ ность ядерной локализации YB-1, процессированного 20S протеасомой, и

на его участие в репарации Д НК. Известно, что накопление YB-1 в ядрах

клеток опухолей является маркером плохого прогноза и лекарственной

устойчивости при многих видах рака. В несение точечны х аминокислотны х

замен в место расщ епления YB-1 протеасомой мож ет бы ть одним из

способов преодоления YB-1-опосредованной лекарственной устойчивости.

Основные положения, выносимые на защиту.

1.

YB-1

расщ епляется

20S

протеасомой

in

vitro

по

двум

альтернативны м сайтам – пептидны м связям после E216 и E219.

5

О трицательны й заряд аминокислотны х остатков в полож ениях 216 и 219

принципиален для э ффективного расщ епления. Расщ епление происходит в

соответствии с моделью ш пильки.

2. О верэ кспрессия полноразмерного или укороченного YB-1 не влияет

на скорость пролиферации клеток NIH3T3, но делает их более устойчивы ми

к действию доксорубицина. Укороченная форма белка действует более

э ффективно, особенно при вы соких концентрациях доксорубицина.

3. Процессинг 20S протеасомой является достаточны м условием для

перехода YB-1 в ядро, где он входит в состав Д НК-репарационны х

комплексов.

Апробация работы. Материалы диссертации бы ли представлены на

Меж дународной пущ инской ш коле-конференции молоды х учёны х (Пущ ино,

2008, 2009, 2012) и на еж егодной конференции Института белка РАН

(Пущ ино, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатны х

работ, в том числе 6 статей в реферируемы х ж урналах из списка В АК.

Структура диссертации. Д иссертационная работа излож ена на 139

страницах маш инописного текста и состоит из следующ их разделов:

введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуж дение

результатов и заключение, вы воды, список литературы и прилож ения. Работа

содерж ит 16 рисунков и 6 таблиц. Библиографический указатель включает

308 цитированны х работ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение места связывания YB-1 с 20S протеасомой

Ц елью

первой части данной работы

является более детальное

исследование механизма расщ епления YB-1 20S протеасомой (на рис. 1

представлена детальная структура места расщ епления YB-1).

6

Рис. 1. Доменная организация белка YB-1. С труктура участка расщ епления YB-1 20S

протеасомой детализирована. AP – A/P-богаты й домен, CSD – домен холодового ш ока, CTD – C-

концевой домен, +/- – кластеры полож ительно и отрицательно заряж енны х аминокислотны х

остатков. PEST-мотив вы делен рамкой.

Д ля определения участков YB-1, отвечающ их за связы вание с 20S

протеасомой, помимо полноразмерного белка бы л использован набор его

фрагментов: YB-1 (1–128), полностью лиш ённы й С -концевого домена, и YB-

1 (1–219), которы й представляет собой больш ий продукт расщ епления белка

20S протеасомой (рис. 2А). Кроме того, мы провели поиск в структуре YB-1

PEST-мотивов (богаты пролином (P), глутаминовой кислотой (E), серином

(S) и треонином (T)), которы е являются э лементами нестабильности белков и

могут опосредовать их деградацию

убиквитин/протеасомной системой

(Rogers

et

al.,

1986).

Используя

алгоритм

поиска

PESTfind

(http://www.at.embnet.org/embnet/tools/bio/PESTfind/)

мы

обнаруж или

в

молекуле YB-1 PEST-мотив в области 205–231, которы й содерж ит сайт

расщ епления протеасомой (рис. 1). Мы предполож или, что PEST-мотив

мож ет участвовать в связы вании с протеасомой, поэ тому фрагмент YB-1

(Δ PEST) такж е бы л использован в работе.

Полноразмерны й YB-1 и его фрагменты

преды нкубировали с 20S

протеасомой

в

присутствии

её

ингибитора

MG132,

после

чего

сформировавш иеся белковы е комплексы бы ли преципитированы антителами

против YB-1 (рис. 2Б). О казалось, что с 20S протеасомой взаимодействуют

полноразмерны й YB-1 (WT), а такж е фрагменты YB-1 (Δ PEST) и YB-1 (1–

219), в то время как YB-1 (1–128) с протеасомой не связы вается. Из

результатов э ксперимента мож но заключить, что за связы вание с 20S

протеасомой отвечает участок молекулы YB-1 (129–204), при э том наличие

PEST-мотива не обязательно.

7

Рис. 2. Определение участков связывания YB-1 с 20S протеасомой. (А) С хемы

доменной

организации

использованны х

в

э ксперименте

фрагментов

YB-1.

(Б)

Коиммунопреципитация (ИП) 20S протеасомы с фрагментами YB-1 антителами против YB-1; в

качестве контрольны х использовали преиммунны е антитела. Иммуноблоттинг с антителами

против YB-1 и субъ единицы α5 протеасомы.

2. Расщепление YB-1 20S протеасомой происходит в соответствии с

моделью шпильки

Ранее бы ло показано, что YB-1 расщ епляется 20S протеасомой

э ндопротеолитически, а не подвергается гидролизу с С -конца, однако

молекулярны е детали э того процесса не бы ли до конца установлены (Sorokin

et

al.,

2005).

Принципиально

возмож ны

два

механизма

э ндопротеолитического

расщ епления

YB-1.

Первы й

предполагает

протягивание полипептидной цепи белка, начиная с одного из концов, через

каталитическую полость 20S протеасомы до тех пор, пока сайт расщ епления

не окаж ется в непосредственной близости от каталитического центра (рис.

3А). В торой потенциальны й механизм – э то расщ епление в соответствии с

моделью

ш пильки:

неструктурированны й

С -концевой

домен

YB-1

склады вается наподобие ш пильки, например, благодаря взаимодействию

чередующ ихся кластеров полож ительно

и

отрицательно

заряж енны х

аминокислотны х

остатков,

а

затем

такая

ш пилька

проникает

в

каталитическую полость 20S протеасомы, где в её верш ину вносится разры в

(рис. 3A).

8

Рис. 3. Исследование механизма расщепления YB-1 20S протеасомой. (А) Модели

расщ епления YB-1. (Б) С хемы

доменной организации использованны х в э ксперименте

фрагментов YB-1. (В ) Модели расщ епления YB-1-CSD. (Г) Расщ епление форм YB-1 20S

протеасомой in vitro. Электрофорез в SDS-ПААГ, окраска Coomassie R-250. NN-концевой

фрагмент YB-1, C и C* – C-концевы е фрагменты YB-1 и YB-1-CSD соответственно.

Чтобы установить, какой из двух механизмов верны й, нам нуж но бы ло

исключить возмож ность проникновения С -конца молекулы YB-1 в полость

20S протеасомы. Д ля э того мы получили белок YB-1, к С -концу которого

генноинж енерны м методом бы л присоединён ещ ё один домен холодового

ш ока (рис. 3Б). Этот домен представляет собой пятитяж евой β-баррель, и его

размеры не позволяют ему проникать в полость 20S протеасомы без участия

вспомогательны х белков. Такой довесок на С -конце делает возмож ны м

проникновение YB-1 в полость 20S протеасомы только в виде ш пильки и,

если наш а гипотеза верна, не повлияет на его расщ епление (рис. 3В ).

Эксперимент показы вает, что такой модельны й субстрат расщ епляется 20S

протеасомой in vitro, как и белок дикого типа (рис. 3Г, дорож ки 3–6).

С овпадение размеров больш их (N-концевы х) фрагментов, образующ ихся при

расщ еплении YB-1 (WT) и YB-1-CSD, указы вает на расщ епление в одном и

том ж е месте. Таким образом, наш и данны е свидетельствуют в пользу

э ндопротеолиза YB-1 20S протеасомой согласно модели ш пильки.

9

3. В молекуле YB-1 есть два альтернативных сайта расщепления

20S протеасомой

Локализация сайта расщ епления YB-1 – пептидная связь меж ду E219 и

G220 – указы вает на участие каспазоподобной активности протеасомы.

Каспазоподобная активность – э то одна из трёх протеолитических

активностей протеасомы, которая отвечает за расщ епление пептидны х связей

после отрицательно заряж енны х аминокислотны х остатков. Методом сайт-

направленного мутагенеза бы ли получены препараты белка YB-1, в которы х

остаток E219 заменён на другие остатки: E219D, E219N, E219A и E219R.

О казалось, что YB-1 (E219D) с синонимичной заменой одного отрицательно

заряж енного остатка на другой расщ епляется 20S протеасомой in vitro так ж е

э ффективно, как и белок дикого типа (рис. 4А, дорож ки 1–2 и 10–11). Замена

на нейтральны е аминокислоты в YB-1 (E219N) и YB-1 (E219A) привела к

частичному ингибированию

расщ епления, а замена на полож ительно

заряж енны й аргинин сделала YB-1 (E219R) практически полностью

устойчивы м к протеолизу (рис. 4А, дорож ки 3–5 и 12–14). Таким образом,

мы

подтвердили важ ность отрицательно заряж енного аминокислотного

остатка, находящ егося непосредственно перед местом расщ епления, для

ограниченного протеолиза YB-1 20S протеасомой.

Помимо сниж ения общ ей э ффективности расщ епления, замены E219R,

E219N и E219A оказы вают влияние на характер продуктов расщ епления YB-

1 20S протеасомой. В

то время как больш ий (N-концевой) продукт

расщ епления YB-1 (WT) и YB-1 (E219D) представлен одним полипептидом,

среди продуктов расщ епления YB-1 (E219R), YB-1 (E219N) и YB-1 (E219A)

наблюдается гетерогенность (рис. 4Б, дорож ки 1–5). Наличие нескольких

продуктов расщ епления указы вает на сущ ествование альтернативного сайта

расщ епления YB-1 20S протеасомой.

10

Рис. 4. Исследование особенностей расщепления YB-1 20S протеасомой. (А)

Расщ епление YB-1 (WT) и его мутантны х форм 20S протеасомой in vitro. О краш ивание Coomassie

R-250. (Б) Ф рагмент правой панели рис. 4А увеличен, чтобы показать гетерогенность продуктов

расщ епления YB-1. (В ) Масс-спектральны й анализ продуктов расщ епления YB-1 (WT) и YB-1

(E219A) 20S протеасомой. (Г) Коиммунопреципитация (ИП) 20S протеасомы с мутантны ми

формами YB-1 за антитела против YB-1. Иммуноблоттинг с антителами против YB-1 и

протеасомы.

субъ единицы α5 20S

Мы провели масс-спектральны й анализ продуктов расщ епления YB-1

(WT) и YB-1 (E219A) 20S протеасомой. Д ействительно, помимо пептидов 2–

219 и 220–324, среди продуктов расщ епления YB-1 (E219A) бы ли

обнаруж ены дополнительны е пептиды 2–216 и 217–324 (рис. 4В ). Таким

образом, пептидная связь меж ду E216 и V217 служ ит альтернативны м

сайтом расщ епления YB-1 20S протеасомой. Учиты вая структурное сходство

двух сайтов (отрицательно заряж енны й аминокислотны й остаток перед

местом расщ епления), мож но предполож ить, что здесь такж е задействована

каспазоподобная активность протеасомы. Интересно, что белок YB-1

(E216A), как и YB-1 (E219A), оказался лиш ь частично устойчивы м к

11

действию 20S протеасомы, в то время как двойная замена (E216/219A)

практически полностью стабилизировала YB-1 (рис. 4А и 4Б, дорож ки 5–7 и

14–16).

Использованны е в работе формы

YB-1 проинкубировали с 20S

протеасомой и преципитировали белковы е комплексы с помощ ью антител

против

YB-1.

Количество

протеасомы,

соочищ ающ ееся

с

YB-1

проанализировали с помощ ью иммуноблоттинга с антителами против α5-

субъ единицы

протеасомы. В ы яснилось, что использованны е в работе

аминокислотны е замены не сказы ваются на связы вании YB-1 с протеасомой

(рис. 4Г).

В

заключение, удаление PEST-мотива, содерж ащ его оба сайта

расщ епления, привело к практически полной устойчивости YB-1 (Δ PEST) к

расщ еплению 20S протеасомой in vitro (рис. 4А, дорож ки 8 и 17). Эти данны е

указы вают на важ ность э того участка для процессинга YB-1 под действием

20S протеасомы, хотя, как отмечалось вы ш е, он не нуж ен для связы вания с

ней.

4. Укороченная форма белка YB-1 не влияет на пролиферацию

клеток, но защищает их от повреждающего действия доксорубицина

В торая

часть

данной

работы

посвящ ена

исследованию

функционального значения протеасомного процессинга YB-1 для ж изни

клетки.

Д ля

дальнейш их

э кспериментов

мы

реш или

использовать

укороченны й YB-1 (1–219), которы й имитирует продукт расщ епления YB-1

20S протеасомой.

На основе фибробластов NIH3T3 с использованием системы pRev-

TET-ON/pRevTRE-HA

нами

бы ли

получены

клеточны е

клоны,

э кспрессирующ ие YB-1 (WT) или YB-1 (1–219) с HA-тагом на N-конце под

контролем

индуцибельного

промотора.

После

индукции

промотора

доксициклином уровень белков HA-YB-1 (WT) и HA-YB-1 (1–219) достигал

максимального уровня за 24 часа и оставался стабильны м в течение 7 дней в

присутствии доксициклина (рис. 5А).

12

Рис. 5. Исследование клеточных функций протеолитического фрагмента YB-1. (А)

Индуцированны й синтез HA-YB-1 (WT) и HA-YB-1 (1–219) в линиях клеток NIH3T3. (Б) Анализ

ядерно-цитоплазматического распределения белков HA-YB-1 (WT) и HA-YB-1 (1–219).

Ц итоплазматические и ядерны е фракции, иммуноблоттинг с антителами против HA-тага, гистона

H3 и β-тубулина. (В ) Иммунофлуоресцентная микроскопия клеток, синтезирующ их HA-YB-1

(WT) и HA-YB-1 (1–219), окраш ивание антителами против HA-тага. Я дра визуализировали

окраской

DAPI

(4',6-диамидино-2-фенилиндол).

(Г)

Кривы е

роста

клеточны х

линий,

синтезирующ их HA-YB-1 (WT) и HA-YB-1 (1–219). (Д ) Анализ распределения клеток, стабильно

синтезирующ их HA-YB-1 (WT) и HA-YB-1 (1–219) по фазам клеточного цикла.

Анализ ядерной и цитоплазматической фракций показал, что больш е

половины HA-YB-1 (WT) находится в цитоплазме клеток, в то время как HA-

YB-1 (1–219) локализуется главны м образом в ядре (рис. 5Б). Д анны е

иммунофлуоресцентной микроскопии подтверж дают э то наблюдение (рис.

5В ).

С огласно данны м литературы, накопление YB-1 в ядре клетки мож ет

сопровож даться ускорением или замедлением пролиферации в зависимости

от типа клеток,

а такж е развитием множ ественной лекарственной

13

устойчивости (Shibao et al., 1999; Jurchott et al., 2003; Bergmann et al., 2005;

Evdokimova et al., 2009). Мы реш или проверить, какое действие оказы вают

HA-YB-1 (WT) и HA-YB-1 (1–219) в наш ей э кспериментальной системе. Д ля

э того бы ли построены

кривы е роста контрольны х клеток и клеток,

оверэ кспрессирующ их HA-YB-1 (WT) или HA-YB-1 (1–219). Как видно на

рис. 5Г, ни одна из форм YB-1 не оказала сущ ественного влияния на

скорость пролиферации клеток. Этот вы вод бы л дополнительно подтверж дён

анализом распределения клеток по фазам клеточного цикла. Профиль

распределения оказался почти одинаковы м для контрольны х клеток и

клеток, оверэ кспрессирующ их разны е формы YB-1 (рис. 5Д ).

Ранее наш ей группой бы ло показано, что YB-1 расщ епляется на два

фрагмента при обработке клеток Д НК-повреж дающ ими агентами и что

присутствие укороченного YB-1 мож ет обеспечивать клетке селективное

преимущ ество при росте в условиях генотоксического стресса. Чтобы

проверить, наблюдается ли э то в вы бранной э кспериментальной системе, мы

обработали

клетки

Д НК-повреж дающ им

агентом

доксорубицином

в

наномолярны х концентрациях в течение 14 часов, после чего среду заменили

на среду без доксорубицина. Через 8 дней бы л проведён подсчёт

сформировавш ихся колоний. О верэ кспрессия любой формы YB-1 придавала

клеткам больш ую устойчивость к доксорубицину – при концентрации

доксорубицина 90 нМ количество колоний клеток, оверэ кспрессирующ их

HA-YB-1 (WT) или HA-YB-1 (1–219), почти в 10 раз превы ш ает количество

колоний контрольны х клеток (рис. 6А). При такой постановке э ксперимента,

однако, укороченная форма YB-1 не давала клеткам сущ ественны х

преимущ еств по сравнению с полноразмерны м белком.

С итуация меняется при увеличении дозы доксорубицина до 5 мкМ. В

таких условиях обе формы YB-1 значительно увеличивают вы ж иваемость

клеток, но HA-YB-1 (1–219) оказы вает несколько больш ий защ итны й

э ффект, чем его полноразмерны й вариант (рис. 6Б и 6В ). После

предварительной обработки клеток ингибитором протеасомы MG132 HA-

14

YB-1 (WT) потерял своё защ итное действие, в то время как активность HA-

YB-1 (1–219) в значительной степени сохранилась (рис. 6Б). Эти данны е

позволяют предполагать, что протеасомны й процессинг YB-1 является

необходимы м условием его защ итного действия, и что именно укороченны й

белок обеспечивает вы ж ивание клеток в условиях Д НК-повреж дающ его

стресса.

Рис. 6. Полноразмерный и укороченный YB-1 защищают клетки от действия

доксорубицина. (А) Тест на клоногенность. (Б) Клетки обрабаты вали 5 мкМ доксорубицином при

отсутствии или присутствии MG-132 в течение 14 часов. Клетки окраш ивали трипановы м синим и

подсчиты вали на автоматическом счётчике. (В ) Анализ суб-G0/G1-фракции клеток, обработанны х

как на панели Б.

5. Устойчивые к расщеплению 20S протеасомой формы YB-1 не

защищают клетки от действия доксорубицина

Гены, кодирующ ие HA-YB-1 (WT), HA-YB-1 (E219D), HA-YB-1

(E219R), HA-YB-1 (E219A), HA-YB-1 (E216/219A) и HA-YB-1 (Δ PEST),

бы ли клонированы

в вектор pcDNA3-HA, пригодны й для трансфекции

э укариотических клеток. В

фибробластах NIH3T3 уровни э кспрессии

15

соответствующ их белков бы ли примерно одинаковы ми в нормальны х

условиях роста клеток, то есть точечны е аминокислотны е замены не оказали

влияния на стабильность белка (рис. 7А). О днако варианты YB-1 повели себя

по разному после обработки клеток доксорубицином: расщ епляемы е HA-YB-

1 (WT) и HA-YB-1 (E219D) частично процессировались, в то время как

формы, устойчивы е к расщ еплению in vitro, бы ли стабильны (рис. 7Б).

Интересно, что только расщ епляемы е формы HA-YB-1 (WT) и HA-YB-1

(E219D) сущ ественно увеличили вы ж иваемость клеток после обработки

доксорубицином (рис. 7В ). В месте э ти результаты указы вают на то, что

протеасомны й процессинг действительно является необходимы м условием для

защ итной функции YB-1 при Д НК-повреж дающ ем стрессе.

Рис. 7. Стабильность и защитный эффект мутантных форм белка YB-1. (А) С интез

мутантны х форм YB-1 в фибробластах NIH3T3, временная трансфекция. Иммуноблоттинг с

антителами против YB-1. (Б) и (В ) С табильность мутантны х форм YB-1 in vivo после обработки

клеток доксорубицином и их защ итное действие. Клетки, трансфецированны е как на панели А,

инкубировали с 5 мкМ доксорубицином или оставляли без дополнительной обработки в течение

14 часов. Иммуноблоттинг с антителами против HA-тага (Б) и окраш ивание трипановы м синим и

подсчёт ж ивы х клеток на автоматическом счётчике (В ).

6. Укорочения YB-1 под действием 20S протеасомы достаточно для

его перехода в ядро

О дним из последствий расщ епления YB-1 является переход N-

концевого фрагмента белка в ядро клетки (рис. 5Б и 5В ). О днако до сих пор

не бы ло установлено, является ли расщ епление достаточны м условием

перехода или в него вовлечены дополнительны е факторы. Чтобы разобраться

в э том вопросе, мы реш или использовать классическую модельную систему

16

на основе клеток HeLa для изучения ядерного импорта in vitro (Adam et al.,

1990). Эта система основана на ядрах клеток, иммобилизованны х на

покровны х стёклах. К ядрам добавляют исследуемы й белок-субстрат и

пострибосомны й цитоплазматический лизат клеток HeLa, полученны й

отдельно, как источник растворимы х транспортны х факторов. Через

некоторое время систему отмы вают от белков, которы е не бы ли

транспортированы в ядро, фиксируют и окраш ивают антителами против

исследуемого субстрата. С игнал наблюдается только в том случае, если

белок-субстрат переместился в ядро в условиях реакции. Д ля проверки

работы полученной системы транспорта мы использовали два модельны х

субстрата: глутатион-S-трансферазу (GST) и её производное GST-NLS, к

которому искусственно бы л добавлен сигнал ядерной локализации больш ого

T-антигена вируса SV40. Как и ож идалось, белок GST-NLS перемещ ался в

ядра клеток, в то время как GST оставалась в цитоплазматической фракции и

бы ла вы мы та буферны м раствором (рис. 8А).

Рис. 8. Исследование импорта YB-1 (1–219) в ядро в модельной системе на основе

клеток HeLa. (А) Тестирование модельной системы для изучения ядерного импорта белков in

vitro. В качестве модельны х субстратов использовали GST (не содерж ит сигналов ядерной

локализации, не импортируется в ядро) и GST-NLS (содерж ит классический сигнал ядерной

локализации, импортируется в ядро). О краска антителами против GST. (Б) Импорт белков HA-

YB-1 (WT) и HA-YB-1 (1–219) в ядро в модельной системе. О краска антителами против HA-тага.

17

Д ля того чтобы исключить влияние возмож ны х посттрансляционны х

модификаций и обеспечить отличие от э ндогенного белка, мы использовали

синтезированны е в Escherichia coli HA-YB-1 (WT) и HA-YB-1 (1–219). В

модельной системе ядерного импорта только укороченны й белок HA-YB-1

(1–219) транспортировался в ядро (рис. 8Б). Так как единственной

модификацией белка HA-YB-1 (1–219) по сравнению с HA-YB-1 (WT)

является его укорочение, то мож но заключить, что процессинг YB-1 20S

протеасомой является достаточны м условием для его перехода в ядро.

7. Укороченный и полноразмерный YB-1 по-разному изменяют

профиль экспрессии генов

Ранее сообщ алось, что YB-1 мож ет защ ищ ать клетки от Д НК-

повреж дающ их препаратов опосредованно, стимулируя транскрипцию генов,

вовлечённы х во множ ественную лекарственную устойчивость, таких как

ABCB1 (MDR1). Мы предполож или, что расщ епление YB-1 20S протеасомой

мож ет

оказать

влияние

на

его

способность

связы вать

Д НК

и

транскрипционную активность. Методом изменения подвиж ности Д НК-

белковы х комплексов в геле и методом связы вания на фильтрах бы ло

установлено, что связы вание YB-1 (1–219) с Д НК длиной 660 пар

нуклеотидов примерно в 2 раза слабее, чем связы вание полноразмерного

белка (рис. 9А и Б). Это мож но объ яснить тем, что в укороченном белке

отсутствует больш ая часть C-концевого домена, которы й важ ен для

неспецифичного связы вания Д НК. С другой стороны, связы вание с короткой

одноцепочечной Д НК, содерж ащ ей Y-бокс, не изменилось при укорочении

YB-1, вероятно потому, что э та модификация не затрагивает домен

холодового ш ока, которы й отвечает за распознавание определённы х мотивов

в Д НК (рис. 9В

и Г). Этот результат позволяет предполагать, что

укороченны й белок мож ет сохранять субстратную

специфичность его

полноразмерного варианта.

18

Рис. 9. Влияние укорочения YB-1 на его ДНК-связывающую способность. (А) Анализ

комплексов YB-1 (WT) и YB-1 (1–219) с длинной Д НК, гель-ш ифт. Электрофорез в ПААГ,

радиоавтография. (Б) С вязы вание на фильтрах. Комплексы YB-1 с Д НК фильтровали через две

мембраны :

нитроцеллюлозную

(верхний

слой)

и

нейлоновую

(ниж ний

слой).

Д НК

визуализировали радиоавтографией. (В ) и (Г) С вязы вание белков YB-1 (WT) и YB-1 (1–219) с

короткой одноцепочечной Д НК, содерж ащ ей Y-бокс.

Д алее мы провели анализ транскриптома клеток NIH3T3, стабильно

оверэ кспрессирующ их HA-YB-1 (WT) или HA-YB-1 (1–219). Д анны е для

дальнейш его анализа бы ли отобраны по уровню значимости (p0,01) и затем

по изменению уровня э кспрессии более чем в 1,75 раза. Таким образом нам

удалось обнаруж ить 18 генов, э кспрессия которы х изменялась в клетках,

оверэ кспрессирующ их обе формы

YB-1, по сравнению

с клетками,

трансфецированны ми пусты м вектором. Кроме того, идентифицированы ещ ё

56 и 21 ген в клетках, оверэ кспрессирующ их HA-YB-1 (WT) и HA-YB-1 (1–

219) соответственно, э кспрессия которы х уменьш алась или увеличивалась по

сравнению с контрольны ми клетками (рис. 10А).

19

трансфецированны х пусты м вектором.

С

помощ ью

базы

данны х

DAVID

Bioinformatics

Database

(http://david.abcc.ncifcrf.gov)

мы

классифицировали

дифференциально

э кспрессированны е гены. О казалось, что HA-YB-1 (WT) влияет в основном

на активность генов, связанны х с цитоскелетом и метаболизмом Д НК, тогда

как HA-YB-1 (1–219) действует на гены, ответственны е за формирование

внеклеточного матрикса, передачу сигнала в клетке и защ иту от апоптоза

(рис. 10Б). Нам не удалось обнаруж ить изменений в активности гена ABCB1

ни в одном из случаев. Таким образом, укорочение YB-1, по всей видимости,

мож ет изменять биологическую активность белка и приводить к изменению

э кспрессии разны х групп генов. Эти изменения, однако, не дают чёткого

объ яснения, каким образом укороченны й белок защ ищ ает клетки от

действия доксорубицина.

8. Укороченный белок YB-1 входит в состав ДНК-репарационных

белковых комплексов

Д ругой потенциальной функцией укороченного YB-1 является участие

в репарации Д НК. Ранее сообщ алось, что YB-1 обладает повы ш енны м

20

Рис. 10. Влияние расщепления YB-1 на его транскрипционную активность. (А)

Изменение профиля э кспрессии генов при оверэ кспрессии полноразмерного и укороченного YB-

1. (Б) Ф ункциональная категоризация генов, э кспрессия которы х меняется на уровне РНК при

оверэ кспрессии

YB-1

(WT)

и

YB-1

(1–219)

по

сравнению

с

уровнем

в

клетках,

сродством к Д НК, повреж дённой генотоксическими препаратами, и к Д НК,

содерж ащ ей неспаренны е основания (Ise et al., 1999; Gaudreault et al., 2004).

Мы проверили влияет ли протеасомны й процессинг белка на его сродство к

таким Д НК. Бы ло обнаруж ено, что обработка доксорубицином не влияет на

сродство YB-1 (WT) и YB-1 (1–219) к двухцепочечной Д НК длиной 660 пар

нуклеотидов (рис. 11А и Б). В то ж е время укороченны й белок, в отличие от

полноразмерного, проявляет чуть больш ее сродство к короткой Д НК,

содерж ащ ей неспаренны е основания, по сравнению с комплементарно

спаренной Д НК (рис. 11В и Г). Эти данны е позволяют предполагать, что

укороченны й YB-1 мож ет принимать участие в узнавании и связы вании

повреж дённы х участков Д НК.

Помимо прямого узнавания повреж дённой Д НК, YB-1 мож ет бы ть

задействован в формировании Д НК-репарационны х белковы х комплексов.

Такие комплексы среди прочих белков включают MRN (Mre11–Rad50–

Nbs1). Клетки NIH3T3 бы ли временно трансфецированы

генетической

конструкцией, кодирующ ей белок YB-1 (1–219) с SFB-тагом (S-таг, FLAG-

таг и стрептавидинсвязы вающ ий белок) на C-конце, после чего обработаны

доксорубицином

или

э топозидом.

Затем

клетки

лизировали

и

преципитировали

комплексы

с

участием

YB-1

(1–219)

на

смолу,

конъ югированную со стрептавидином, а затем на смолу, конъ югированную с

S-белком. Как видно на рис. 12А и Б, YB-1 (1–219) формирует комплекс с

белками Mre11 и Rad50 в клетках, обработанны х Д НК-повреж дающ ими

агентами, но не в нормальны х условиях роста. Полученны е результаты бы ли

подтверж дены

данны ми

иммунофлуоресцентной

микроскопии:

после

обработки клеток э топозидом HA-YB-1 (1–219) колокализуется в ядре с

Mre11 и маркером двухцепочечны х разры вов Д НК, фосфорилированны м

гистоном H2A.X (γH2A.X) (рис. 12В ). Таким образом, защ итное действие

укороченного YB-1, по всей видимости, обусловлено его участием в

репарации

повреж дений

Д НК,

вы званны х

такими

агентами,

как

доксорубицин и э топозид.

21

Рис. 11. Влияние укорочения на способность YB-1 связывать доксорубицин-

модифицированную ДНК или ДНК, содержащую неспаренные основания. (А) С вязы вание

YB-1 (WT) с доксорубицин-модифицированной Д НК, гель-ш ифт. Электрофорез в ПААГ,

радиоавтография. (Б) С вязы вание YB-1 (1–219) с доксорубицин-модифицированной Д НК, гель-

ш ифт. (В ) С вязы вание YB-1 (WT) с Д НК, содерж ащ ей неспаренны е основания, гель-ш ифт. (Г)

С вязы вание YB-1 (1–219) с Д НК, содерж ащ ей неспаренны е основания, гель-ш ифт.

В ходе работы мы установили, что способность YB-1 защ ищ ать клетки

от действия Д НК-повреж дающ их вещ еств связана с его участием в

репарации Д НК, а не с регуляцией э кспрессии генов, отвечающ их за

множ ественную лекарственную устойчивость. Протеасомны й процессинг

представляет собой механизм, обеспечивающ ий бы стры й переход YB-1 в

ядро, которы й чрезвы чайно важ ен для своевременного ответа на стресс.

Мож но предполож ить, что клетки, которы е содерж ат некоторое количество

укороченного белка в ядрах в нормальны х условиях, будут более

подготовлены к воздействию лекарств. Подобны й механизм мож ет играть

больш ую роль в устойчивости раковы х клеток к химиотерапии.

22

Рис. 12. Укороченный YB-1 входит в состав ДНК-репарационных комплексов. (А) и

(Б) Коиммунопреципитация YB-1 (1–219) с компонентами репарационны х комплексов.

Иммуноблоттинг, окраска антителами против FLAG-тага, Mre11 и Rad50. (В ) Клетки NIH3T3,

временно трансфецированны е генетической конструкцией pTRE-HA-YB-1 (1–219), обрабаты вали

э топозидом в течение 14 часов. Клетки фиксировали и окраш ивали антителами против HA-тага,

γH2A.X, Mre11.

ВЫВОДЫ

1.

Установлено,

что

за

протеолитическое

расщ епление

YB-1

20S

протеасомой отвечает участок (205–231), а за связы вание с ней – (129–204).

2. Показано, что YB-1 расщ епляется 20S протеасомой в соответствии с

моделью ш пильки.

3. О бнаруж ен дополнительны й сайт расщ епления YB-1 – после E216.

Д оказана важ ность присутствия отрицательно заряж енны х аминокислотны х

остатков в полож ениях 216 и 219 для э ффективного расщ епления YB-1 in

vitro.

4. Показано, что оверэ кспрессия полноразмерного или укороченного YB-1 не

влияет на скорость пролиферации клеток NIH3T3.

5. Показано, что оверэ кспрессия полноразмерного и укороченного YB-1

делает клетки NIH3T3 более устойчивы ми к повреж дающ ему действию

23

доксорубицина. Укороченны й белок действует более э ффективно, особенно

при вы соких дозах доксорубицина.

6. Продемонстрировано, что только расщ епляемы е 20S протеасомой

мутантны е формы YB-1 защ ищ ают клетки от действия доксорубицина.

7. Показано, что протеасомны й процессинг YB-1 является достаточны м

условием для его перехода в ядро клетки.

8. Установлено, что полноразмерны й и укороченны й YB-1 по-разному

меняют профиль э кспрессии генов.

9. Показано, что укороченны й YB-1 имеет больш ее сродство к Д НК,

содерж ащ ей неспаренны е основания, в отличие от полноразмерного белка.

10. Показано, что укороченная форма YB-1 входит в состав Д НК-

репарационны х комплексов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах:

1.

А.В.

С орокин,

Е.Р.

Ким,

Л.П.

О вчинников.

Ядерно-

цитоплазматический транспорт белков // Успехи биологической химии. –

2007. – T. 47. – C. 89–128.

A.V. Sorokin, E.R. Kim, L.P. Ovchinnikov. Nucleocytoplasmic Transport

of Proteins // Biochemistry (Mosc). – 2007. – Vol. 72. – №13. – P. 1439–1457.

2. А.В. С орокин, Е.Р. Ким, Л.П. О вчинников. Протеасомная система

деградации и процессинга белков // Успехи биологической химии. – 2009. –

T. 49. – C. 3–76.

A.V. Sorokin, E.R. Kim, L.P. Ovchinnikov. Proteasome System of Protein

Degradation and Processing // Biochemistry (Mosc). – 2009. – Vol. 74. – №13. –

P. 1411–1442.

3. И.А. Елисеева, Е.Р. Ким, С.Г. Гурьянов, Л.П. О вчинников, Д.Н.

Лябин. Y-бокс-связы вающ ий белок (YB-1) и его функции // Успехи

биологической химии. – 2011. – T. 51. – C. 65–132.

24

I.A. Eliseeva, E.R. Kim, S.G. Guryanov, L.P. Ovchinnikov, D.N. Lyabin.

Y-Box-Binding Protein 1 (YB-1) and Its Functions // Biochemistry (Mosc). –

2011. – Vol. 76. – №13. – P. 1402–1433.

4. P. Pestryakov, D.O. Zharkov, I. Grin, E.E. Fomina, E.R. Kim, L. Hamon,

I.A. Eliseeva, I.O. Petruseva, P.A. Curmi, L.P. Ovchinnikov, O.I. Lavrik. Effect of

the multifunctional proteins RPA, YB-1, and XPC repair factor on AP site

cleavage by DNA glycosylase NEIL1 // J Mol Recognit. – 2012. – №25. – P. 224–

233.

5. Н.И. Моисеева, Т.П. С тромская, Е.Ю. Ры балкина, А.В. В айман, М.А.

Малы ш кина, Е.Р. Ким, И.А. Елисеева, И.В. Кулаковский, Л.П. О вчинников,

А.А. С тавровская. В лияние внеклеточного белка YB-1 на культивируемы е

клетки опухолей молочной ж елезы // Биологические мембраны. – 2012. – Т.

29. – №5. – С. 340–348.

N.I. Moiseeva, T.P. Stromskaya, E.Yu. Rybalkina, A.V. Vaiman, M.A.

Malyshkina, E.R. Kim, I.A. Eliseeva, I.V. Kulakovskiy, L.P. Ovchinnikov, and

A.A. Stavrovskaya. Effects of Extracellular YB-1 Protein on Cultured Cells of

Human Breast Cancer // Biochemistry (Mosc). – Supplement Series A: Membrane

and Cell Biology. – 2013. – Vol. 7. – №1. – P. 21–28.

6. E.R. Kim, A.A.Selyutina, I.A. Buldakov, V. Evdokimova, L.P.

Ovchinnikov, A.V Sorokin. The proteolytic YB-1 fragment interacts with DNA

repair machinery and enhances survival during DNA damaging stress // Cell

Cycle. – 2013. – №12; 24. – P. 3791– 3803.

Тезисы докладов:

1. А.В. С орокин, В.М. Евдокимова, А.А. С елютина, Е.Р. Ким, С.Г.

Гурьянов, А.В. В айман, А.А. С тавровская, Л.П. О вчинников. Белок YB-1 –

регулятор онкотрансформации и потенциальная миш ень при терапии рака:

тезисы доклада // С импозиум «Результаты фундаментальны х и прикладны х

исследований для создания новы х лекарственны х средств». Материалы

симпозиума. – Москва, 2008. – С. 195–196.

25

2. А.В. С орокин, В.М. Евдокимова, А.В. В айман, А.А. С елютина, Е.Р.

Ким, Т.П. С тромская, Е.Ю. Ры балкина, О.В. Калита, Н.Ю. О парина, Р.А.

Ты чко, Е.С. Кропотова, Т.Д. Маш кова, А.А. С тавровская, Л.П. О вчинников.

Белок YB-1 в онкогенной трансформации и множ ественной лекарственной

устойчивости раковы х клеток: тезисы доклада // IV С ъ езд Российского

общ ества биохимиков и молекулярны х биологов. С борник тезисов. –

Новосибирск, 2008. – С. 249.

3. А.В. С орокин, Е.Р. Ким, А.А. С елютина, А.В. В айман, А.А.

С тавровская, В.М. Евдокимова, Л.П. О вчинников. Белок YB-1 в онкогенной

трансформации и множ ественной лекарственной устойчивости раковы х

клеток: тезисы доклада // 12-я Меж дународная ш кола-конференция молоды х

учёны х. С борник тезисов. – Пущ ино, 2008. – С. 56–57.

4. Е.Р. Ким, А.В. С орокин, И.А. Булдаков, Л.П. О вчинников. Механизм

расщ епления белка YB-1 20S протеасомой: тезисы

доклада // 13-я

Меж дународная ш кола-конференция молоды х учёны х. С борник тезисов. –

Пущ ино, 2009. – С. 44.

5. Д.А. Мордовкина, Е.Р. Ким, И.А. Елисеева, Л.П. О вчинников.

Изучение механизма транспорта белка YB-1 в ядро: тезисы доклада // 16-я

Меж дународная ш кола-конференция молоды х учёны х. С борник тезисов. –

Пущ ино, 2012. – С. 131–132.

26



Похожие работы:

«Антипов Владислав Анатольевич ПРИНЦИПЫ ПОСТРОЕНИЯ И ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ПЕСНИ ВОСТОЧНОГО СОЛОВЬЯ (Luscinia luscinia L., 1758) 03.02.04 зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2015 2 Работа выполнена на кафедре зоологии позвоночных биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова. Научный руководитель: доктор биологических наук, Иваницкий Владимир Викторович...»

«Колесникова Алиса Станиславовна АНОКТАМИНЫ ВКУСОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ: КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пущино – 2016 ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Идентификация ионных каналов, вовлеченных в сигнальные процессы во вкусовых клетках млекопитающих, является актуальной проблемой, поскольку молекулярные механизмы детекции вкусовых стимулов и принципы...»

«НИКУЛИНА Ольга Юрьевна БАБЕЗИОЗ СОБАК В РЯЗАНСКОЙ ОБЛАСТИ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ОСОБЕННОСТИ ЭПИЗООТОЛОГИИ, ЛЕЧЕНИЕ) Специальность: 03.02.11 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва 2016 Ведущая организация: аграрный университет. ФГБОУ ВО Ставропольский государственный Защита диссертации состоится 10 февраля 2016 г. в 14:30 ч на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на...»





 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.