авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

На правах рукописи

Бучельников Анатолий Сергеевич

Развитие теории интерцепторно-протекторного действия

при совместном связывании биологически активных соединений с ДНК

03.01.02

Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Пущино

2015

Работа выполнена на кафедре «Физика» ФГАОУ ВО «Севастопольский государ-

ственный университет»

Научный руководитель:

Евстигнеев Максим Павлович,

доктор физико-математических наук,

профессор

Официальные оппоненты:

Нечипуренко Юрий Дмитриевич,

доктор физико-математических наук, профес-

сор, Институт молекулярной биологии имени

Н.Н. Энгельгардта РАН, старший научный со-

трудник отдела физики биологических систем

Русаков Алексей Вячеславович,

кандидат физико-математических наук, Ин-

ститут теоретической и экспериментальной

биофизики РАН, старший научный сотрудник

лаборатории биофизики возбудимых сред

Ведущая организация:

ФГБУН Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится «___» _______ 2015 г. в __-__ на заседании совета Д 002.093.01

по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соиска-

ние ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном

учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики

Российской академии наук по адресу: ул. Институтская, 3, г. Пущино, 142290,

Московская область.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по ад-

ресу: ул. Институтская, 3, г. Пущино, 142290, Московская область, и на сайте

ИТЭБ РАН: http://web.iteb.psn.ru.

Автореферат диссертации разослан «___» _______ 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

к.ф.-м.н.

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биологический синергизм, возникающий при введе-

нии в биосистему комбинаций биологически активных соединений (БАС), состав-

ляет основу некоторых режимов современной химиотерапии онкологических за-

болеваний. В связи с этим управляемость и предсказуемость отклика биосистемы

на комбинации БАС является чрезвычайно важным для стимулирования даль-

нейшего прогресса в данной области медицинских исследований.

Одними из наиболее изученных групп БАС, демонстрирующих биологиче-

ский синергизм при совместном использовании, являются ароматические соеди-

нения ДНК-направленного действия, механизм биологического действия которых

связывают с процессами нековалентного комплексообразования: гетероассоциа-

ции препаратов и/или конкуренции за места посадки на ДНК. Если молекулярное

комплексообразование лежит в основе наблюдаемого в эксперименте биологиче-

ского синергизма, то должна существовать количественная взаимосвязь биологи-

ческих и физико-химических параметров. В явном или неявном виде поиск этой

взаимосвязи проводился многими исследователями, что в итоге позволило обна-

ружить некоторые важные корреляции биологических и физико-химических па-

раметров в различных частных системах, и заложить основы теории интерцептор-

но-протекторного действия (ИПД). Накопленный к настоящему времени биологи-

ческий и физико-химический материал, а также имеющиеся представления о ме-

ханизмах биологического действия в комбинациях ДНК-связывающихся БАС,

ставят вопрос о необходимости создания единой обобщенной теории ИПД.

Цель и задачи исследования. Целью работы является построение обоб-

щенной теории интерцепторно-протекторного действия в многокомпонентных

системах ДНК-связывающихся БАС. Для достижения поставленной цели реша-

лись следующие задачи:

1. Создание статистико-термодинамического базиса для описания интерцептор-

ного механизма: разработка модели многокомпонентных взаимодействий в си-

стемах Лиганд1 — Лиганд2 — … — ЛигандN без ограничений на константы

комплексообразования, концентрации и стехиометрию комплексов.

2. Формулировка физической модели биологического синергизма в системах

Препарат — Интерцептор1 — … — Интерцептор(N – 1) — ДНК.

3. Вывод уравнений баланса массы и установление взаимосвязи физико-

химических и биологических параметров на модели полимерной ДНК.

4. Редукция уравнений теории ИПД к частным случаям и их верификация.

5. Анализ в рамках обобщенной теории ИПД опубликованных данных биологи-

ческих экспериментов in vitro по комбинированному введению ароматических

БАС в биосистему.

Объект исследования: многокомпонентные системы Препарат — Интер-

цептор1 — … — Интерцептор(N – 1) — ДНК.

Предмет исследования: молекулярное комплексообразование и взаимосвязь

процессов комплексообразования с биологическим эффектом in vitro в многоком-

понентных системах.

3

Методы исследования: метод статистической термодинамики — для вывода

основных соотношений теории ИПД, метод спектрофотометрии в УФ и видимом

диапазоне длин волн — для верификации уравнений теории.

Научная новизна полученных результатов. Впервые проведено объеди-

нение различных фрагментарных представлений и подходов к количественному

описанию биологического синергизма в многокомпонентных системах в единую

обобщенную теорию ИПД, оперирующую полимерной моделью ДНК в качестве

биорецептора. Показано, что все основные предложенные количественные моде-

ли многокомпонентных систем являются частным случаем данной теории. В об-

щем виде установлена взаимосвязь между относительным изменением биологиче-

ского эффекта при комбинированном введении ароматических БАС (фактор AD )

и параметрами межмолекулярного взаимодействия. Выявлено фундаментальное

проявление интерцепторного механизма действия в виде гиперболической взаи-

мосвязи константы гетероассоциации и биологического эффекта на примере ан-

тимутагенной активности хлорофиллина по отношению к мутагенам из ряда гете-

роциклических аминов. Впервые дано косвенное экспериментальное подтвержде-

ние значимости протекторного механизма действия в системах Препарат — Ко-

феин — ДНК.

Практическое значение полученных результатов. Обобщенная теория

ИПД предоставляет «инструмент» анализа биологического эффекта при комбини-

рованном использовании ДНК-связывающихся БАС как функции физико-

химических параметров межмолекулярного взаимодействия. Данная теория фор-

мирует научную основу «управления» и «предсказания» биологического отклика

системы, индуцированного введением комбинаций БАС. Помимо этого разрабо-

танная модель многокомпонентной гетероассоциации может быть использована в

любых физико-химических приложениях, связанных с необходимостью количе-

ственного описания сложного динамического равновесия любого числа взаимо-

действующих молекулярных компонентов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Физическая модель комбинированного действия ДНК-связывающихся

БАС в системах Препарат — Интерцептор1 — Интерцепор2 — … —

ДНК дает интерпретацию механизма биологического синергизма препа-

ратов ДНК-направленного действия на межмолекулярном уровне.

2. Бесконечномерные модели с последовательным характером агрегации

являются наиболее предпочтительным инструментом анализа механиз-

мов интерцепторно-протекторного действия.

3. Статистико-термодинамическая модель многокомпонентной гетероассо-

циации Лиганд1 — Лиганд2 — … — ЛигандN формирует математиче-

ский базис анализа интерцепторно-протекторного механизма действия

комбинаций ДНК-связывающихся препаратов.

4. Обобщенная теория ИПД позволяет дать количественное описание дан-

ных биологического эксперимента in vitro при комбинированном дей-

ствии ДНК-связывающихся препаратов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационного исследования

были представлены и обсуждены на: международных научно-технических конфе-

4

ренциях «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и

химии» (Севастополь, Украина) в 2009 и 2011 гг.; конференции молодых ученых

«Современные проблемы теоретической физики» (Киев, Украина) в 2010 г.; V

съезде Украинского биофизического общества (Луцк, Украина) в 2011 г.; между-

народных научных конференциях молодых ученых «Ломоносовские чтения» (Се-

вастополь, Украина) в 2011 и 2012 гг.; Харьковской конференции молодых уче-

ных «Радиофизика, Электроника, Фотоника и Биофизика» (Харьков, Украина) в

2011 и 2012 гг.; международной научно-методической конференции «Современ-

ные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные

процессы» (Воронеж, Россия) в 2013 г.; международной конференции молодых

ученых «Ломоносов-2014» (Москва, Россия) в 2014 г. Тезисы перечисленных до-

кладов опубликованы.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ, в том

числе 10 статей в научных журналах и 10 тезисов докладов на международных

конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех разде-

лов и заключения. Полный объем диссертации состоит из 166 страниц, из них

список использованных литературных источников — 249 ссылок — занимает 15

страниц. Диссертация содержит 9 таблиц и 19 рисунков, в том числе один рису-

нок на отдельном листе.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, указана связь дис-

сертации с научными программами и темами, сформулированы цели и задачи

диссертационного исследования, показана новизна и практическая значимость

полученных результатов, а также указан личный вклад соискателя в опублико-

ванные в соавторстве работы.

В первом разделе проведен краткий критический анализ накопленных к

настоящему времени данных медико-биологических экспериментов на примере

трех веществ (так называемых перехватчиков, или интерцепторов): кофеин, ри-

бофлавин (витамин B2) и хлорофиллин. Показано, что применение этих веществ

совместно с ароматическими БАС как на in vitro, так и на in vivo уровне, выража-

ется в изменении медико-биологического эффекта последних, причиной чему яв-

ляется наличие межмолекулярных взаимодействий. Сформулированы представ-

ления об интерцепторном и протекторном механизмах действия перехватчиков.

Изложены общие принципы построения количественной теории интерцепторно-

протекторного действия (ИПД), показана эволюция от редуцированных теорий

ИПД к олигомерной теории. Основным недостатком существующих теорий ИПД

признано отсутствие в них строгого учета как интерцепторного, так и протектор-

ного механизмов действия.

Второй раздел посвящен краткому описанию использованного в диссерта-

ции спектрофотометрического метода исследования водных растворов аромати-

ческих БАС. Рассмотрены методы численного анализа данных, в частности, мето-

ды нелинейной оптимизации, такие как метод Левенберга — Марквардта и метод

5

(1)

Идея ответа на вопрос, какая из двух мод является предпочтительной при

моделировании межмолекулярной агрегации, состоит в рассмотрении влияния

потери трансляционных и вращательных степеней свободы агрегата при добавле-

нии к нему новых молекул (мономеров либо агрегатов меньшего порядка) на саму

реакцию комплексообразования. Показано, что в реакции типа (1б) изменения

трансляционной и ротационной энтропий всегда будут более отрицательными,

чем изменения этих энтропий в реакции типа (1а), независимо от каких-либо

предположений относительно формы агрегатов. Это означает, что молекулярная

само- и гетероассоциация, происходящая в соответствии с реакцией агрегации

случайного типа (1б), энтропийно менее выгодна. Таким образом, допущение о

последовательном характере само- и гетероассоциации молекул БАС и аромати-

ческих молекул-интерцепторов является корректным.

Обоснование справедливости использования бесконечномерных моделей аг-

регации. В настоящее время в литературе не существует единого физически обос-

нованного критерия выбора той или иной модели агрегации в молекулярных си-

стемах в контексте ограничений, вводимых на длину образующихся комплексов.

Сравнение двух предельных случаев моделирования самоассоциации — димер-

ной и бесконечномерной моделей, — которые с одинаковой невязкой описывают

экспериментальные данные, показало, что они являются неразличимыми (взаимо-

заменяемыми) при условии 2K2  K. Причина неразличимости кроется в частном

решении общей системы уравнений, описывающих эффект неразличимости.

Сформулирован ряд важных рекомендаций, касающихся выбора той или иной

модели межмолекулярной ассоциации. В частности, установлено, что общеприня-

тый критерий низких или высоких концентраций для использования соответ-

ственно димерной или бесконечномерной моделей в численном анализе экспери-

ментальных данных некорректен.

6

ломаных доверительных областей (trust-region dogleg method). Вкратце изложены

базовые понятия статистико-термодинамических методов моделирования много-

компонентного равновесия: метод трансфер-матриц (transfer matrix method) и ме-

тод производящих последовательность функций (sequence generating function

method).

Третий раздел диссертационного исследования посвящен созданию стати-

стико-термодинамического базиса интерцепторного механизма действия, т.е., в

первую очередь, всеобъемлющей математической модели, учитывающей образо-

вание произвольных по составу и длине комплексов молекул.

Доказательство термодинамической выгодности последовательной меж-

молекулярной агрегации. При моделировании молекулярной агрегации использу-

ются два подхода, различающиеся по размеру (длине) присоединяемого агрегата.

Наращивание агрегата путем последовательного присоединения мономеров ха-

рактеризуется последовательной модой (способом) агрегации (1а), а в случае, ко-

гда агрегат образуется из двух меньших агрегатов, говорят о случайной моде (1б):

Ki

Ki

j

Xi1  X1  Xi (а); X Xk  Xi

i j k (б).

(2)

,

(3)

2

7



,





Анализ существующих статистико-термодинамических подходов к описа-

нию молекулярной гетероассоциации позволяет выделить как минимум два серь-

езных недостатка, присущих каждому из них:

1) некорректный учет так называемых «отраженных» комплексов, т.е. фи-

зически идентичных зеркально симметричных относительно друг друга комплек-

сов, образующихся при бесконечномерной агрегации;

2) приближенный учет так называемых краевых эффектов, т.е. зависимости

экспериментально измеряемого параметра от типа соседних молекул в комплексе.

В настоящей работе создана строгая статистико-термодинамическая модель

гетероассоциации, учитывающая образование молекулярных комплексов произ-

вольного состава и длины и лишенная отмеченных выше недостатков. Ключевым

объектом модели является большая статистическая сумма, на основании которой

далее могут быть записаны уравнения, связывающие параметры молекулярного

равновесия с экспериментально наблюдаемым параметром. В диссертации приве-

дены два способа вывода модели — с помощью метода трансфер-матриц и метода

производящих последовательность функций. Здесь рассмотрим только метод

трансфер-матриц, имея в виду, что в работе доказана полная эквивалентность

двух подходов при описании молекулярной гетероассоциации в многокомпонент-

ных системах БАС.

Вывод большой статистической суммы с помощью метода трансфер-

матриц. Основным объектом матричной модели N-компонентной гетероассоциа-

ции является трансфер-матрица М размера N N :

K11C1

K12C2

K1NCN

K21C1

K22C2

K2NCN

M

KN1C1 KN 2C2

KNNCN

где Kij — равновесная константа ассоциации молекул типа i и j, Cj — молярная

перебрать все возможные комбинации n молекул N различных типов в n-мере.

Далее, полученная степень матрицы M может быть использована для получения

большой статистической суммы N-компонентной системы:

концентрация молекул типа j. Возведение матрицы M в степень n 1 позволяет

1

n1

 

n1

CN, I — единичная матрица порядка N.

cM

1

c I M

1,

где c C1 C2

Большая статистическая сумма (2) содержит статистические веса всех воз-

можных комплексов, формирующихся в растворе. Весь набор этих комплексов

содержит также зеркально симметричные, или «отраженные», комплексы. При

условии равенства равновесных констант KijK они становятся физически не-

различимыми. Принимая во внимание, что «отраженные» комплексы являются

физически эквивалентными, скорректируем большую статистическую сумму (2):

ji

  symm

corr 

ческого центра комплексов. Для получения развернутого вида

вспомогательные матрицы:

symm

вводятся

преобразований статистическая сумма симметричных относительно своего гео-

метрического центра комплексов принимает вид:

(4)

Наконец, подстановка выражений (2) и (4) в выражение (3) позволяет получить

скорректированную большую статистическую сумму N-компонентной системы:

2

Если ввести вспомогательные матричные объекты:











,









то выражение (5) принимает окончательный вид:

1

где symm — статистическая сумма симметричных относительно своего геометри-

2

K11C1

00



K11C12









2

0

K22C2

0

MS

, Md = M M

00

KNNCN

K21C12

K22C2

K2NCN

KN1C12

KN 2C2

KNNCN

2

2

2

2

.

2

2

2

2

K12C2

K12NCN

2

2

2

2

Возведение матрицы Md в степень n 1 дает статистическую сумму двух «поло-

вин» симметричных комплексов общей длиной 2 n 1. После математических

1

n

symm 

n1

cI MSMd11

cI MS I Md

1.

1

1

1

corr  c I M

I MS I Md

.

(5)



1

K11

K12

K1N

C1

00

K11

00

K21

K22

K2N

0

0

K22

0

K

, ΔC

, KS

KN1

KN 2

KNN

CN

0

0

KNN

0

C2

0

0

1

1

1

2

corr  1ΔC1  K

ΔC1  KS ΔC2  Kd

1.

(6)

 







Вывод выражения для закона сохранения массы. Знание corr позволяет по-

лучить равновесные параметры взаимодействия молекул в растворе, основываясь

на формализме статистических сумм, который уже не связан с конкретным спосо-

бом вывода статистической суммы. Общие концентрации C0i могут быть найдены

путем дифференцирования большой статистической суммы (5) по натуральному

логарифму соответствующих мономерных концентраций Ci . Закон сохранения

массы в N-компонентной системе в матричной форме имеет вид:

1

1

1

1



ΔΤ

I M

11ΔC I M

I Md

11ΔC I  2MS  Md I Md

. (7)



2

где ΔT — диагональная матрица размером N N , содержащая на главной диаго-

нали общие концентрации соответствующих компонентов системы.

Вывод выражения для экспериментально наблюдаемого параметра. Экспе-

риментально наблюдаемый параметр 0i

молекул i-го типа может быть получен

i

8

путем усреднения собственных наблюдаемых параметров комплексов s:

Исследование частных случаев модели многокомпонентной гетероассоциа-

ции. Выведенная обобщенная модель легко сводится к известным в литературе

частным случаям, что косвенно доказывает ее универсальность. Важным частным

случаем обобщенной матричной модели является ситуация, когда один из компо-

нентов присутствует в растворе в таких малых концентрациях, что допускается

его существование только в мономерной форме либо в виде несвязанных молекул,

либо в составе гетерокомплекса с молекулами других типов, агрегирование кото-

рых, в свою очередь, происходит уже без каких-либо ограничений. Модель такой

агрегации обозначается как 1:n — для двухкомпонентной системы, 1:m:n — для

трехкомпонентной системы и т.д. Большая статистическая сумма для таких си-

стем в общем виде записывается следующим образом:

.

(9)

Ci 0

ξ0  ξmtΔT1 ξmξ S ,

(8)

1m

1m 

11

N1





m

NN

ξm

; ξ

m 



 

где m— наблюдаемый параметр молекулы, находящейся в мономерном состо-

янии; fis— мольная доля; s  m  s. После проведения некоторых преоб-

1N

.

NN

s

i

sm

i

i

i

i

разований данное выражение может быть записано в матричном виде:

где ξ0N N матрица, содержащая на главной диагонали экспериментально

наблюдаемые параметры молекул всех типов; матрица S является производной по

логарифмам равновесных констант ассоциации;

0i  m 

i

  fis,

1  corr

corr

Подстановка выражения (5) в (9) при N  2 и N  3 позволяет получить стати-

corr

нейшем будут применены при построении обобщенной теории ИПД.

Верификация моделей гетероассоциации проводилась в два этапа: расчет

равновесных параметров гетероассоциации в двухкомпонентных системах и затем

подстановка полученных значений в расчет трехкомпонентных систем. В рамках

настоящей работы были проведены эксперименты, в которых одним из компонен-

тов являлся краситель (профлавин (PF)), другим — вещество, не поглощающее

свет в видимой области (кофеин (CAF), никотинамид (NMD)). Во всех экспери-

ментах концентрация профлавина составляла 1,26·10–5 моль/л. Здесь и далее экс-

перименты проводились при постоянных pH = 6,86 и температуре T = 298 K.

Изменения в спектрах красителя (рис. 1, 2) свидетельствуют о наличии вза-

имодействия между молекулами PF и CAF и формировании в растворе гетеро-

комплексов PF-CAF и PF-NMD. Аппроксимация концентрационных зависимостей

по 1:n модели (рис. 1б, 2б) позволила рассчитать параметры двухкомпонентного

равновесия (таблица 1), а именно константу гетероассоациации Kh и коэффици-

9

стические суммы 1 для 1:n и 1:m:n моделей соответственно, которые в даль-

corr

Ci

Ci

Ci 0

Kh , л/моль

h , л/(моль·см)

R2

Система

PF-CAF

139,7

30246

0,9937

PF-NMD

31,5

33710

0,9878

Верификация модели трехкомпонентных взаимодействий заключалась в

подстановке в исходную вычислительную процедуру значений равновесных па-

раметров само- и гетероассоциации, полученных ранее из экспериментов по ис-

следованию одно- и двухкомпонентных систем. При этом осуществлялся только

расчет мономерных концентраций по уравнениям закона сохранения массы, под-

10

ент экстинкции гетеродимера h . Также в таблице 1 приведены значения коэффи-

циентов детерминации R2, свидетельствующие о хорошем качестве аппроксима-

ции.

(а)

(б)

Рис. 1. Электронные спектры поглощения растворов PF-CAF (а) и зависимость оптической

плотности этих растворов от концентрации CAF, снятая на длине волны 444,5 нм (б); точками

показаны экспериментальные данные, сплошной линией – теоретическая аппроксимация.

(а)

(б)

Рис. 2. Электронные спектры поглощения растворов PF-NMD (а) и зависимость оптической

плотности этих растворов от концентрации NMD, снятая на длине волны 444,5 нм (б); точками

показаны экспериментальные данные, сплошной линией – теоретическая аппроксимация.

Таблица 1 — Численные значения равновесных параметров гетероассоциации

гонка теоретической кривой титрования под экспериментальную не производи-

лась. Расчетная кривая на рис. 3б достаточно неплохо описывает эксперименталь-

ную, что указывает на справедливость 1:m:n модели гетероассоциации.

(а)

(б)

Рис. 3. Электронные спектры поглощения трехкомпонентных растворов PF-CAF-NMD (а) и за-

висимость оптической плотности этих растворов от концентрации CAF, снятая на длине волны

444,5 нм (б). Концентрация NMD составляла 1·10–2 моль/л, см. обозначения рисунка 1. Точками

показаны экспериментальные данные, сплошной линией – теоретическая аппроксимация.

Четвертый раздел диссертации посвящен развитию теории интерцепторно-

протекторного действия (ИПД) на случай многокомпонентного конкурентного

связывания биологически активных соединений с ДНК.

Формулировка основных положений обобщенной теории ИПД. Отправной

точкой создания обобщенной теории ИПД является представление о гетероассо-

циации (интерцепторный механизм) и конкуренции за места посадки на ДНК

(протекторный механизм) как о двух базовых молекулярных процессах, изменя-

ющих эффективную концентрацию препарата при введении интерцепторов и мо-

дулирующих таким образом измеряемый биологический отклик. Сформулирова-

ны пять базовых допущений обобщенной теории ИПД, описывающих условия

протекания реакций нековалентного комплексообразования и имеющих характер

постулатов.

Закон сохранения массы в N-компонентной ДНК-содержащей системе за-

писывается в виде системы N уравнений вида

(10)

типа, Zhet — большая статистическая сумма N-компонентной системы без ДНК,

i — доля сайтов ДНК, занятая молекулами лиганда i-го типа, N0 — общая кон-

центрация ДНК, выражаемая в моль пар оснований на литр. Для определения до-

лей i система уравнений типа (10) дополняется системой N уравнений МакГи —

фон Хиппеля (J. Mol. Biol., 1974, 86, 469-489):

11

где Ci0 , Ci

— соответственно общая и мономерная концентрации лиганда i-го

Zhet

lnCi

Ci0 

 i N0 ,

где ni — количество пар оснований в сайте ДНК, занимаемом одной молекулой i-

го типа, KiN — равновесная микроскопическая константа комплексообразования

лиганда i-го типа с ДНК. Использование уравнений МакГи — фон Хиппеля (11)

отражает ключевую особенность обобщенной теории ИПД — учет взаимодей-

ствия лигандов с полимерной ДНК.

Расчет факторов RD и AD . Основу количественной теории ИПД составля-

ет анализ значений так называемых факторов RD и

AD , вводимых для оценки

(11)

ni 1

N

n



k

n



1 

k

N

iKiNCi 1

kk 

N

k1

,

1

k1

n

1k

k

k1

вкладов протекторного и интерцепторного механизмов в общее взаимодействие

интерцепторов с ДНК и вычисляемых по формулам:

0

C

0

RD

, AD

.

(12)

C

ствующий препарат) при «отключенной» гетероассоциации и «включенном» ком-

H

X-ДНК при «включенной» гетероассоциации и «отключенном» комплексообразо-

0

«отключенных» гетероассоциации и комплексообразовании всех интерцепторов с

ДНК; X — мольная доля молекул препарата X, связанных с ДНК в присутствии

молекул интерцепторов при «включенных» гетероассоциации и комплексообра-

зовании. Фактор AD

тождественен измеряемому в биологическом эксперименте

изменению некоторого параметра при добавлении интерцепторов (например, доля

подвергнувшихся апоптозу клеток, процент мутировавших клеток и пр.), норми-

рованному к значению этого же параметра, но в отсутствии интерцепторов.

Модификация уравнений обобщенной теории ИПД для анализа спектрофо-

тометрических данных заключается в объединении 1:n модели гетероассоциации

с подходом МакГи — фон Хиппеля с использованием системы уравнений вида

(10). Выведено выражение для экспериментально наблюдаемого параметра, поз-

воляющего проводить аппроксимацию зависимостей оптической плотности пре-

парата от концентрации другого компоненты системы.

Верификация уравнений обобщенной теории ИПД заключалась в определе-

нии степени отклонения расчетной концентрационной зависимости наблюдаемого

параметра от экспериментально измеренной. Были проведены эксперименты тит-

рованием в трехкомпонентных системах Бромистый этидий (EB) — Кофеин

(CAF) — ДНК и Профлавин (PF) — Кофеин (CAF) — ДНК (использовалась ДНК

молок лосося). На рис. 4, 5 представлены соответственно спектры поглощения

бромистого этидия и профлавина в их смесях с кофеином, с одной стороны, и с

кофеином и ДНК, с другой.

12

X

  X

X

  X

0

H

0

X

  X

X

где X— мольная доля комплексов X-ДНК (под X понимается основной, дей-

плексообразовании всех интерцепторов с ДНК; X — мольная доля комплексов

вании всех интерцепторов с ДНК; X— мольная доля комплексов X-ДНК при

0

0

(а)

(б)

Рис. 4. Электронные спектры поглощения растворов EB (x = 50 мкмоль/л) с CAF (а) и с CAF и

ДНК (N = 28.9 мкмоль/л) (б). На рисунке (б) пунктирной линией изображен спектр чистого EB.

(а)

(б)

Рис. 5. Электронные спектры поглощения растворов PF (x = 13 мкмоль/л) с CAF (а) и с CAF и

ДНК (N = 19.5 мкмоль/л) (б). На рисунке (б) пунктирной линией изображен спектр чистого PF.

(а)

(б)

Рис. 6. Зависимости оптической плотности растворов с бромистым этидием (а) и профлавином

(б) от концентрации кофеина на длинах волн 480 нм и 444 нм соответственно. Точками показа-

ны экспериментальные данные, сплошными линиями – аппроксимирующие кривые.

13

0

0

В обоих случаях из сравнения двух наборов спектров четко наблюдается

достаточно сильное взаимодействие как между красителем и кофеином, так и

между красителем и ДНК. Четко прослеживаются батохромные сдвиги полос по-

глощения обоих красителей, что свидетельствует об образовании достаточно

прочных комплексов.

Аппроксимации подвергались значения оптической плотности растворов

различной концентрации, снятой на максимуме поглощения свободного красителя

(рис. 6). Из рисунка видно, что аппроксимация кривых является вполне удовле-

творительной, что свидетельствует об успешной верификации и адекватности по-

добранной модели.

Редуцирование обобщенной теории ИПД к олигомерной теории. Показано,

что выведенная и верифицированная ранее олигомерная теория ИПД не противо-

речит обобщенной теории, являясь ее частным случаем. Действительно, пред-

ставляя олигомеры ДНК как отдельные независимые участки полимерной ДНК,

уравнения МакГи — фон Хиппеля трансформируются в уравнения Скэтчарда

(Ann. New York Acad. Sci., 1949, 51, 660-672):

i

.

(13)

K Ck

k1

Следует заметить, что при N = 2 уравнения (13) полностью соответствуют урав-

нениям из олигомерной теории ИПД.

Ре-параметризация уравнений обобщенной теории ИПД. Для того чтобы

иметь возможность применять обобщенную теорию ИПД к исследованию конку-

рентного связывания в биологических системах в условиях in vitro были подобра-

ны подходящие концентрации компонентов (Препарат, Интерцептор, ДНК),

называемые квазифизиологическими условиями:

x0 = 10 мкмоль/л, y0 — var, N0 = 40 мкмоль/л.

(14)

На рис. 7 изображены зависимости факторов RD , AD от концентрации ко-

феина в трехкомпонентных системах Препарат — Кофеин — ДНК, рассчитанные

по формулам (12).

Рис. 7. Зависимости факторов R и A от концентрации кофеина при квазифизиологических

условиях (14) в системах Препарат — Кофеин — ДНК. В качестве препарата были использова-

ны PF (профлавин), NOV (новатрон), EB (бромитсый этидий), DOX (доксорубицин), DAU (дау-

номицин).

14

KiNCi

N

kN

1 

D

D

AD

Из рис. 7 видно, что зависимости факторов RD и AD , а также последовательность

кривых AD

в виде PF→NOV→EB→DOX→DAU, отражающая чувствительность

биологического эффекта того или иного препарата к добавлению кофеина, в це-

лом совпадают с полученными ранее аналогичными значениями при помощи оли-

гомерной теории ИПД.

Теория ИПД без учета протекторного механизма. В качестве частного слу-

чая обобщенной теории ИПД можно рассматривать ситуацию, при которой ис-

ключен протекторный механизм действия, что выражается в исключении из урав-

нений закона сохранения массы всех слагаемых, ответственных за комплексооб-

разование интерцепторов с ДНК, т.е. эквивалентно обнулению доли θY. Это до-

пущение вводится некоторыми исследователями на основании малости значения

константы комплексообразования интерцептора с ДНК либо невозможности про-

ведения качественного независимого эксперимента в системе Интерцептор —

ДНК с целью установления точного значения этой константы. Соответствующее

упрощение исходных уравнений олигомерной теории ИПД приводит к выраже-

нию:

(16)

Примером исследования мультимодального связывания в диссертации явля-

ется спектрофотометрический эксперимент по изучению связывания EB с ДНК

при различных концентрациях и температурах. Предполагается, что EB связыва-

ется с полимерной ДНК двумя способами: интеркаляцией и электростатическим

связыванием с внешней поверхностью полимера. Анализ термодинамики ком-

плексообразования EB-ДНК проводился по концентрационным зависимостям оп-

тической плотности смеси на длине волны, соответствующей максимуму погло-

щения красителя в мономерной форме в диапазоне температур 19-55 °C. В основу

анализа данных эксперимента было положено предположение о том, что лиганд

существует в растворе в мономерной и в связанной с ДНК формах.

Расчетные значения равновесной константы комплексообразования уклады-

ваются в график, изображенный на рис. 8. Характерной особенностью этой зави-

симости является ее выраженная нелинейная форма, которая с одной стороны

может интерпретироваться как проявляющаяся в «загибе» кривой при понижении

температуры. Различные варианты интерпретации этого феномена указывают на

15

Теория ИПД без учета интерцепторного механизма. В этом случае кон-

станты гетероассоциации обнуляются и Zhet в (10) редуцируется к статистической

сумме самоассоциации лиганда. Тогда система (11) описывает обычное независи-

мое связывание с ДНК N типов лигандов либо, что то же самое, — связывание с

ДНК одного и того же лиганда, но различными способами (т.н. случай мультимо-

дального связывания). Для многокомпонентной ДНК-содержащей системы в

предположении того, что каждый i-й лиганд может связываться с ДНК числом

мод mi , система N уравнений закона сохранения массы (10) примет вид:

Kh y0

.

(15)

1 Kh y0

mi



N0.

j1

Ci0  Ci

i j

 

то, что эта особенность кривых Вант-Гоффа отражает именно факт бимодального

связывания красителя EB с ДНК.

Рис. 8. Зависимость ln K от 1/Т комплек-

Рис. 9. Результаты аппроксимации экспе-

сообразования EB-ДНК: 1 – эксперимен-

риментальных данных по системе PF-

тальные данные; 2 – аппроксимирующая

CAF-ДНК. Точками показаны экспери-

прямая, параллельно перенесенная в точ-

ментальные данные, сплошными линия-

ку касания с графиком (1) при Т = 298 K.

ми – аппроксимирующие кривые.

Доказательство необходимости учета протекторного механизма в кофе-

ин-содержащих системах. Рассмотрим случай нековалентного связывания с ДНК

двух классических интеркаляторов — бромистого этидия и профлавина — в при-

сутствии кофеина. Исключение из рассмотрения протекторного механизма озна-

чало бы отсутствие взаимодействия между интерцептором и ДНК, т.е. обнуление

соответствующих констант взаимодействия в системе уравнений баланса массы

обобщенной теории ИПД (10), (11). Были проанализированы зависимости оптиче-

ской плотности в исследованных системах EB-CAF-ДНК и PF-CAF-ДНК (послед-

няя в качестве примера представлена на рис. 9). Сплошными линиями указаны

расчетные кривые титрования, аналогичные тем, что указаны на рис. 6. Пунктир-

ными линиями показаны кривые, рассчитанные по тем же уравнениям, в которых

произведено обнуление константы комплексообразования интерцепторов с ДНК.

Аппроксимация экспериментальных зависимостей становится заметно хуже, что

однозначно указывает на частичное несоответствие модели эксперименту. Полу-

ченный результат является экспериментальным доказательством важности учета

протекторного механизма в трехкомпонентных кофеин-содержащих системах

(при условии нековалентного связывания всех компонент с ДНК) в диапазоне

концентраций, близких к квазифизиологическим концентрациям (14).

Надежность количественного описания биологического эффекта в рамках

обобщенной теории ИПД. В рамках диссертационного исследования был выяснен

вопрос о надежности оценки величины изменения биологического эффекта (фак-

тор AD ). Показано, что погрешность измерения концентраций, входящих в систе-

му уравнений закона сохранения массы, практически не играет значимой роли в

оценке фактора AD . Это отражает свойство «инертности» фактора AD по отноше-

нию к квазифизиологическим концентрациям, экспериментальное определение

которых обычно сильно затруднено, и частично снимает проблему переноса фи-

16

зико-химических параметров взаимодействия на реальную биологическую систе-

му.

Наибольшее влияние на значение фактора AD оказывают три основных па-

раметра: константы гетероассоциации Kh , а также константы комплексообразо-

вания препарата ( KXN ) и интерцептора ( KYN ) с ДНК. Сказанное означает, что если

взаимодействия в системе Препарат — Интерцептор — ДНК укладываются в ин-

терцепторно-протекторную гипотезу, то данные биологического эксперимента

(фактор AD ) должны демонстрировать корреляцию с данными параметрами. Об-

суждение взаимосвязи физико-химических параметров взаимодействия и данных

биологического эксперимента in vitro будет рассмотрено ниже.

Применение теории ИПД к данным биологического эксперимента. Можно

выделить два варианта приложения теории ИПД к данным биологического экспе-

римента in vitro:

1) точечная оценка AD , т.е. сравнение фактора AD для различных препара-

тов X при фиксированной концентрации интерцепторов Y.

2) оценка по зависимости AD от концентрации интерцептора y0.

Вся совокупность известных нам опубликованных данных биологического

эксперимента in vitro условно может быть разбита на две группы:

1) измерение цитостатического или цитотоксического эффекта действия

лиганда X в присутствии Y на пролифелирующих клеточных линиях;

2) измерение мутагенной активности лиганда X в присутствии Y в бактери-

альных системах.

Точечная оценка фактора AD по данным мутагенного теста. Анализ лите-

ратурных данных указывает на существование фундаментальной взаимосвязи ве-

личины измеряемого в мутагенном тесте биологического параметра и величины

константы гетероассоциации. В целях проверки адекватности теории ИПД мута-

генному тесту были взяты данные по большому числу ароматических мутагенов

имидазо-хинолинового типа (IQ) в присутствии молекулы-интерцептора хлоро-

филлина (CHL), представленные в работе Дэшвуда и Гуо (Environ. Mol. Mutagen.,

1993, 22, 164-171). Согласно современным представлениям, мутагены IQ-типа

действуют путем ковалентного связывания с ДНК, что исключает роль протек-

торного механизма со стороны CHL. Эта ситуация может быть промоделирована

в рамках теории ИПД без протекторного механизма: т.е. необходимо использо-

вать уравнение (15) для расчета фактора AD . С учетом микромолярных концен-

траций CHL, использованных в работе Дэшвуда, получена связь измеряемого в

биологическом эксперименте параметра I50 с константой гетероассоциации Kh в

виде:

где B — некоторый постоянный множитель. Аппроксимация выражением (17)

данных Дэшвуда дает значительно лучшее соответствие эксперименту (R2 = 0.94),

чем исходная аппроксимация линейной зависимостью (R2 = 0.82), представленная

в цитируемой работе (рис. 10).

17

I50  B Kh

.

(17)

Полученные результаты указывают на возможность применения теории

ИПД к данным мутагенного теста при условии доминирования интерцепторного

механизма действия. Выявление фундаментального эффекта действия интерцеп-

торного механизма в форме (17) для мутагенного теста является одним из важных

достижений теории ИПД вообще и результатов настоящей работы в частности.

Точечная оценка фактора AD по данным эксперимента на пролифелирую-

щих клеточных линиях. Анализ литературы показал, что практически во всех из-

вестных случаях (точечная оценка для систем доксорубицин — кофеин, новатрон

— кофеин и оценка по концентрационной зависимости в системе топотекан —

кофеин) теория ИПД дает хорошее согласие с данными эксперимента на проли-

фелирующих клеточных линиях в отношении измеряемого биологического пара-

метра, характеризующего изменение цитотоксической активности основного пре-

парата при введении интерцептора. Таким образом, пролифелирующие клеточные

линии остаются объектом, наиболее однозначно описываемым в рамках теории

ИПД.

Рис. 10. Корреляция значений I

со зна-

Рис. 11. Зависимости фактора A в систе-

чениями констант гетероассоциации IQ-

ме IQ-CAF-ДНК от концентрации кофеи-

CHL: пунктирная прямая — линия ре-

на: экспериментально пересчитанный A ,

грессии из работы Дэшвуда и Гуо;

расчет A с учетом (пунктирная кривая) и

сплошная кривая — зависимость, рассчи-

без учета (сплошная кривая) протектор-

танная по уравнению (17).

ного механизма.

Оценка по концентрационной зависимости фактора AD . С использованием

мутагенного теста группа исследователей из Университета Гданьска (Польша)

измерили зависимость изменения мутагенной активности ароматических аминов

типа IQ в присутствии различных ксантинов, включая CAF (Bioorg. Chem., 2005,

33, 402-413; Bioorg. Chem., 2011, 39, 10-17). На рис. 11 точками представлены эти

данные в пересчете на единицы AD . Отсутствие учета протекторного механизма

(см. результаты анализа данных Дэшвуда и Гуо выше) приводит к более каче-

ственной аппроксимации экспериментальной зависимости AD y0.

18

50

 

D

D

D

образом.

1. Сформулированная

физическая модель комбинированного действия

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе дано развитие обобщенной теории интерцепторно-

протекторного действия (ИПД) для комбинаций ДНК-связывающихся ароматиче-

ских БАС в системах Препарат — Интерцептор1 — Интерцептор2 — … — ДНК.

Можно выделить следующие основные направления дальнейшего развития

теории ИПД:

1. Строгое преобразование уравнений теории ИПД на случай ковалентного

связывания основного препарата с ДНК.

2. Поиск корреляции между константами комплексообразования препарата

и интерцепторов с ДНК, с одной стороны, и данными биологического экспери-

мента, с другой, потребует постановки специального биологического эксперимен-

та и может стать важным тестом на справедливость применения теории ИПД к

конкретным комбинациям БАС.

3. В настоящее время накоплен значительный объем биологических данных

о синергизме комбинаций препаратов белок-направленного действия. Представ-

ляет интерес адаптация теории ИПД к системам подобного рода.

ВЫВОДЫ

Основные выводы диссертации могут быть сформулированы следующим

ДНК-связывающихся биологически активных соединений (БАС) в системах Пре-

парат — Интерцептор1 — Интерцептор2 — … — ДНК позволяет проводить ко-

личественный анализ экспериментальных данных по связыванию БАС с биоре-

цептором.

2. Дано

статистико-термодинамическое обоснование эмпирическому до-

пущению последовательного характера агрегации, а также доказана эквивалент-

ность бесконечномерных моделей само- и гетероассоциации с точки зрения опи-

сания ими экспериментальных данных.

3. На основании методов трансфер-матриц и производящих последователь-

ность функций получена новая матричная формулировка уравнений закона со-

хранения массы и наблюдаемого экспериментального параметра в модели много-

компонентной некооперативной гетероассоциации Лиганд1 — Лиганд2 — … —

ЛигандN. Созданный на основе данной формулировки вычислительный алгоритм

позволяет проводить количественный анализ многокомпонентного равновесия в

системах агрегирующих ароматических БАС.

4. Сформулированы уравнения баланса массы в обобщенной теории интер-

цепторно-протекторного действия (ИПД) с использованием модели полимерной

ДНК в качестве биорецептора, проведена ре-параметризация уравнений. Анализ

данных спектрофотометрического титрования показал важность учета протектор-

ного механизма в системах Препарат — Кофеин — ДНК.

5. Теория ИПД применена к количественному описанию данных измерения

апоптоза в пролифелирующих клеточных линиях и мутагенности в бактериаль-

19

ных системах, индуцированных комбинациями ароматических БАС. Выявлена

функциональная взаимосвязь константы гетероассоциации и наблюдаемого в

биологическом эксперименте параметра при условии доминирования интерцеп-

торного механизма действия.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.

Барановский С.Ф., Чернышев Д.Н., Бучельников А.С., Евстигнеев М.П.

Термодинамический анализ комплексообразования бромида этидия с ДНК в

водном растворе // Биофизика. — 2011. — Т. 56, № 2. — С. 235-241.

2.

Buchelnikov A.S., Hernandez Santiago A.A., Gonzalez Flores M., Vazquez

Ramirez R., Davies D.B., Evstigneev M.P. General analysis of competitive binding

in drug-interceptor-DNA systems // Eur. Biophys. J. — 2012. — V. 41, № 3. — P.

273-283.

3.

Evstigneev M.P., Buchelnikov A.S., Evstigneev V.P. Random versus sequential

pathway of molecular self-assembly // Phys. Rev. E. — 2012. — V. 85, № 6. —

Art. No. 061405.

4.

Buchelnikov A.S., Khrustalev A.F., Evstigneev M.P. Development of an analytical

approach to study a three-component hetero-association by means of spectropho-

tometry // Appl. Spectrosc. — 2013. — V. 67, № 1. — P. 29-35.

5.

Evstigneev M.P., Buchelnikov A.S., Kostjukov V.V., Pashkova I.S., Evstigneev

V.P. Indistinguishability of the models of molecular self-assembly // Supramol.

Chem. — 2013. — V. 25, № 4. — P. 199-203.

6.

Buchelnikov A.S., Evstigneev V.P., Rodríguez Oropeza L.E., Evstigneev M.P. On

the reliability of quantitation of biological effect in drug-interceptor-DNA systems

// Eur. Biophys. J. — 2013. — V. 42, № 4. — P. 315-319.

7.

Buchelnikov A.S., Evstigneev V.P., Evstigneev M.P. General statistical-

thermodynamical treatment of one-dimensional multicomponent molecular hetero-

assembly in solution // Chem. Phys. — 2013. — V. 421. — P. 77-83.

8.

Buchelnikov A.S., Evstigneev M.P. Quantitative correlation of the in vitro biologi-

cal effect with parameters of molecular complexation in mutagen-interceptor sys-

tems // J. Theor. Biol. — 2014. — V. 357. — P. 268-271.

9.

Бучельников А.С., Рубакина В.А., Мосунов А.А., Евстигнеев М.П. Примене-

ние теории интерцепторно-протекторного действия к данным биологического

эксперимента in vitro // Биофиз. вестник. — 2013. — Т. 30, № 2. — С. 106-117.

10. Бучельников А.С., Евстигнеев В.П. Моделирование многокомпонентного

равновесия биологически активных ароматических молекул в водном

растворе // Вестник СевНТУ (серия «Физика и математика»). — 2011. — Т.

99. — С. 3-11.

11. Евстигнеев В.П., Бучельников А.С. Модель некооперативных взаимодей-

ствий в многокомпонентной смеси ароматических соединений // Материалы

V международной конференции “Актуальные вопросы теоретической и при-

кладной биофизики, физики и химии” 21-25 апреля 2009 г. — Севастополь.

— 2009. — С. 145-146.

20

12. Buchelnikov A.S., Evstigneev V.P. Matrix model of non-co-operative interactions

of aromatic compounds in multicomponent mixture // Program and Abstracts of

Young Scientists Conference “Modern Problems of Theoretical Physics” 22-24

December 2010. — Kyiv. — 2010. — P. 51.

13. Бучельников А.С., Евстигнеев М.П. Исследование межмолекулярной ассоци-

ации в системе профлавин-кофеин-никотинамид // Тезисы докладов X Меж-

дународной научной конференции “Ломоносов-2011” 25-28 апреля 2011 г. —

Севастополь. — 2011. — С. 262.

14. Евстигнеев В.П., Бучельников А.С. Влияние неточности определения физико-

химических параметров взаимодействия ароматических соединений в ДНК-

содержащих системах на расчет фактора AD // Материалы VII Международ-

ной конференции “Актуальные вопросы биологической физики и химии” 26-

30 апреля 2011 г. — Севастополь. — 2011. — С. 204-205.

15. Евстигнеев М.П., Евстигнеев В.П., Бучельников А.С. Теория интерцепторно-

протекторного действия при совместном связывании с ДНК ароматических

биологически активных соединений // Тези доповідей V з’їзду Українського

біофізичного товариства 22-25 червня 2011 р. — Луцьк. — 2011. — С. 56-57.

16. Бучельников А.С., Евстигнеев В.П. Надежность определения факторов RD и

AD в трехкомпонентных ДНК-содержащих системах // Материалы XI конфе-

ренции молодых ученых “Радиофизика, Электроника, Фотоника и Биофизи-

ка” 29 ноября — 1 декабря 2011 г. — Харьков. — 2011. — С. 67.

17. Бучельников А.С., Румянцев А.А., Евстигнеев В.П. Некоторые аспекты тео-

рии интерцепторно-протекторного действия молекул в трехкомпонентных

ДНК-содержащих системах // Тезисы докладов XI Международной научной

конференции “Ломоносов-2012” 23-27 апреля 2012 г. — Севастополь — 2012.

— С. 253.

18. Бучельников А.С., Родригес Оропеса Л.Э., Евстигнеев М.П. Обобщенная мо-

дель конкурентного связывания в системах Препарат-Перехватчик-ДНК //

Материалы XII конференции молодых ученых “Радиофизика, Электроника,

Фотоника и Биофизика” 4-7 декабря 2012 г. — Харьков. — 2012. — С. 16.

19. Бучельников А.С., Евстигнеев М.П. Анализ данных биологического экспери-

мента in vitro на основе теории интерцепторно-протекторного действия ДНК-

связывающихся препаратов // Материалы докладов международной научно-

методической конференции “Современные проблемы биофизики сложных

систем. Информационно-образовательные процессы” 24-27 июня 2013 г. —

Воронеж. — 2013. — С. 109-112.

20. Бучельников А.С. Развитие теории интерцепторно-протекторного действия

при совместном связывании биологически активных соединений с ДНК //

Сборник тезисов докладов XXI международной конференции молодых уче-

ных “Ломоносов-2014”. — Москва, 7-11 апреля 2014 г. — С. 36-37.

21

Подписано в печать 30.06.2015. Формат 60×84 1/16.

Гарнитура Times. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 1.

Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИПК НИУ «БелГУ»

308015, г. Белгород, ул. Победы, 85



Похожие работы:

«КУЗЬМИНА УЛЬЯНА ШАФКАТОВНА РЕГУЛЯЦИЯ NMDA-РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2015 Доктор биологических наук Доктор медицинских наук Доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО Башкирский государственный университет, г. Уфа Доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник ФГБНУ Научный центр неврологии,...»





 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.