авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

На правах рукописи

Ларичев Виктор Филиппович

Разработка, характеристика и использование ИФА тест-систем для

диагностики арбовирусных инфекций

03.02.02 – вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва – 2015

Борисевич Сергей Владимирович

Малеев Виктор Васильевич

доктор

биологических

наук,

профессор,

начальник ФГБУ "48 Центральный научно-

исследовательский институт"

Минобороны

России

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАН, ФБУН «Центральный научно-

исследовательский институт эпидемиологии»

Роспотребнадзора, заместитель директора

по научной работе

Ведущая организация:

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпиде-

миологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Минздравa

России

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Бутенко Александр Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

Злобин Владимир Игоревич

академик РАН, ГБОУ ВПО «Иркутский

государственный медицинский университет»

Минздрава России, заведующий кафедрой

микробиологии, вирусологии и иммунологии

с курсом клинической лабораторной

диагностики

ФГБНУ

«Научно-исследовательский

институт

вакцин

и

сывороток

им.

И.И.Мечникова»

Защита состоится «25» марта 2016 г. в 10 часов 00 минут на заседании диссер-

тационного совета Д.001.026.01 на базе ФГБНУ "Институт полиомиелита и вирусных

энцефалитов имени М.П. Чумакова" по адресу: 142782, город Москва, поселение

Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км Киевского шоссе.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального

бюджетного научного учреждения "Институт полиомиелита и вирусных энцефали-

тов имени М.П. Чумакова" и на сайте http://poliomyelit.ru.

Автореферат разослан «___ » ___________ 2016 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Романова Лидия Юрьевна

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Aктуальность

Арбовирусы – это экологическая группа вирусов, передающихся восприим-

чивым позвоночным через укусы кровососущих членистоногих: комаров, клещей,

москитов, мошек и мокрецов. К этой группе тесно примыкают зоонозные вирусы,

циркулирующие среди позвоночных животных без участия кровососущих члени-

стоногих. К ним относятся, в частности, возбудители ряда геморрагических лихора-

док (Ласса, Марбург, Эбола, Аргентинская, Боливийская, Венесуэльская, Бразиль-

ская, с почечным и лёгочным синдромами). Общее число вирусов, относящихся к

этим категориям, составляет примерно 550. По крайней мере, для 100 из них выяв-

лена способность вызывать заболевания людей.

Такие арбовирусные инфекции, как лихорадка денге, геморрагическая лихо-

радка денге, жёлтая лихорадка, восточный, западный, венесуэльский энцефалиты

лошадей, энцефалиты – японский, клещевой, Сент-Луис, долины Муррея, Росио,

Западного Нила, лихорадки долины Рифт, москитные лихорадки, карельская лихо-

радка и другие – далеко не полный перечень опасных для человека арбовирусных

инфекций, представляющих огромное значение для здравоохранения в эндемичных

регионах мира. Опустошительные эпизоотии среди сельскохозяйственных живот-

ных определяют также большое ветеринарное значение многих арбовирусов и дру-

гих зоонозных вирусов (Д.К. Львов, 1991).

Борьба, а часто и этиологическая расшифровка вспышек арбовирусных ин-

фекций затрудняются огромным антигенным разнообразием возбудителей, массив-

ностью эпидемических вспышек с охватом в короткий срок значительных групп

населения, необходимостью лабораторного подтверждения диагноза, зачастую от-

сутствием диагностических препаратов, чем определяется актуальность темы дис-

сертационной работы.

Степень разработанности темы исследования

Достаточно высокая степень разработанности темы определяется многолет-

ними многопрофильными и результативными исследованиями арбовирусов и арбо-

вирусных инфекций в отечественных и зарубежных лабораториях. В ходе много-

летней работы сотрудников НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, мони-

торинга природно-очаговых вирусных инфекций установлена циркуляция возбуди-

телей особо опасных и малоизученных вирусных инфекций на юге Европейской ча-

сти России с использованием классических серологических методов и изоляции ви-

4

русов. Значительный прогресс в этой сфере открывает новые актуальные вопросы,

требующие своего решения.

Цели исследования

Разработка технологии и организация экспериментального производства

ИФА тест-систем для диагностики особоопасных арбовирусных инфекций (Крым-

ской-Конго геморрагической лихорадки, лихорадки Западного Нила, клещевого эн-

цефалита), а так же эндемичных для России малоизученных заболеваний и завозных

тропических инфекций.

Характеристика разработанных препаратов, их сертификация, апробация и

внедрение в практику.

Для выполнения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Создание, характеристика и наработка иммуноферментных тест-систем для

диагностики актуальных для Российской Федерации арбовирусных инфекций: ли-

хорадок Синдбис, Чикунгунья, Западного Нила (ЛЗН), денге, клещевого энцефалита

(КЭ), японского энцефалита (ЯЭ), Крымской-Конго геморрагической лихорадки

(ККГЛ), лихорадок Батаи, Инко, Тягиня, москитной лихорадки Неаполь, москитной

лихорадки Сицилия, Укуниеми, Бханджа, Дхори.

2. Организация экспериментального производства этих тест-систем для обес-

печения профильных научных и практических лабораторий страны в целях их апро-

бации и проведения контроля за эпидситуацией в отношении арбовирусных инфек-

ций в РФ.

4. Определение критериев оценки результатов серодагностического обследо-

вания больных;

5. Определение специфичности и чувствительности экспериментальных диа-

гностических ИФА тест-систем НИИ вирусологии в сравнении с ИФА- и ОТ-ПЦР

тест-системами других производителей.

6. Сертификация диагностических иммуноферментных наборов, внедрение их

в коммерческое производство.

Научная новизна

В результате применения экспериментальных иммуноферментных тест-

систем, разработанных в лаборатории биологии и индикации арбовирусов в НИИ

вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России:

- впервые в 1999 году расшифрована этиология эпидемической вспышки и

изучены эпидемические и клинические характеристики лихорадки Западного Нила в

южном регионе России (Астраханская, Волгоградская области и Краснодарский

5

край). В последующие годы случаи этого заболевания верифицированы в Ростов-

ской, Воронежской, Тульской и других областях, что явилось доказательством зна-

чительного расширения ареала этой инфекции к северу от Астраханской области,

где циркуляция вируса Западного Нила впервые в СССР была установлена в 1963

году.

- Впервые верифицированы случаи ККГЛ в Волгоградской области, Калмы-

кии и Дагестане в 2000 году, что также свидетельствовало о расширении границ

природных очагов ККГЛ в связи с климатическими и биоценологическими измене-

ниями на Европейской части территории России.

- Получены новые данные о распространении, этиологии и роли в патологии

человека таких малоизученных эндемичных для России арбовирусных инфекций

как лихорадки Синдбис, Батаи, Тягиня, Инко, Укуниеми, Бханджа, неаполитанской

и сицилийской москитных лихорадок.

- Определены, используемые в настоящее время в практических лабораториях

страны, критерии оценки результатов применения методов ИФА-IgM и ИФА-IgG

для серологической диагностики лихорадки Западного Нила и ККГЛ.

- Впервые в РФ доказано значение вирусов денге, Чикунгунья, Западного Ни-

ла, москитных лихорадок и лихорадки долины Рифт в этиологии случаев заболева-

ний у пациентов, госпитализированных в лечебные учреждения России после посе-

щения тропических стран. Получены новые данные по этиологии, эпидемиологии и

клинике этих инфекций.

- На основе проведенных исследований разработана оригинальная технология

приготовления пероксидазных конъюгатов иммуноглобулинов и антигенов, исполь-

зуемых в производстве иммуноферментных тест-систем.

- Выделено и депонировано в Государственную коллекцию вирусов: 3 штам-

ма вируса Западного Нила, 4 штамма вируса ККГЛ и 1 штамм вируса Батаи.

Теоретическая и практическая значимость

Шесть типов ИФА тест-систем для диагностики лихорадки ЗН и ККГЛ про-

шли успешные испытания в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича в 2004 г. и рекомендованы

Комитетом по иммунобиологическим препаратам для регистрации в РФ.

Авторские ИФА тест-системы для детекции специфических антител IgM и

IgG, а также антигена вируса ЗН сертифицированы в РФ и внедрены в производство

в ЗАО "Биосервис".

На базе лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии

сотрудниками Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумако-

6

ва и Государственного НИИ Биологического приборостроения проведены успеш-

ные лабораторные испытания ИФА тест-систем ЗАО "Биосервис" для диагностики

ККГЛ и КЭ.

На основании результатов проведенных исследований разработаны норма-

тивно регламентирующие документы: Методические рекомендации для врачей

"Клиническая характеристика вспышки нейроинфекции в Волгограде летом 1999

года и лечебно-диагностическая тактика ведения больных серозными менингитами"

(Волгоград 1999 г.); Методические указания (МУ 3.1.3.002-2000) "Эпидемиологиче-

ский надзор за лихорадкой Западного Нила в Астраханской области, специфическая

диагностика заболевания, меры общественной и личной профилактики" (Астрахань

2000 г.); Методические рекомендации "Мероприятия по борьбе с лихорадкой За-

падного Нила на территории Российской Федерации (Волгоград 2002 г.); Методиче-

ское пособие "Вирусы серогруппы калифорнийского энцефалита и вызываемые ими

заболевания: клинико-эпидемиологическая характеристика, географическое распро-

странение, методы вирусологической и серологической диагностики" (Москва

2003 г.); Учебно-методическое пособие для факультетов последипломного образо-

вания "Новые и возвращающиеся вирусные инфекции в системе биобезопасности

Российской Федерации" (Москва 2014 г.).

Организовано экспериментальное производство иммуноферментных тест-

систем и обеспечение этими препаратами научных и практических лабораторий

страны для осуществления специфической диагностики эндемичных арбовирусных

инфекций.

В течение 1997-2007 г.г. для этих целей практическим и научным лаборатори-

ям России было предоставлено более 4000 ИФА-IgM, ИФА-IgG и ИФА-АГ наборов.

6 типов ИФА тест-систем для диагностики лихорадки ЗН и ККГЛ прошли

успешные испытания в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича в 2004 г. и рекомендованы Ко-

митетом по иммунобиологическим препаратам для регистрации в РФ.

Разработанные нами ИФА тест-системы для детекции специфических антител

IgM и IgG, а также антигена вируса ЗН сертифицированы в РФ и внедрены в произ-

водство в ЗАО "Биосервис".

Совместно с ЗАО "Биосервис", Институтом полиомиелита и вирусных энце-

фалитов им. М.П. Чумакова и Государственного НИИ Биологического приборо-

строения проведены успешные лабораторные испытания ИФА тест-систем для диа-

гностики ККГЛ и КЭ.

7

На технологию приготовления пероксидазных конъюгатов антител и антиге-

нов на основе перйодатного метода подана заявка на патент № 2012134015.

Установлена роль в патологии человека малоизученных эндемичных для Рос-

сии арбовирусных инфекций: лихорадки Синдбис, Батаи, Тягиня, Инко, Укуниеми,

Бханджа, неаполитанской и сицилийской москитных лихорадок.

Определены критерии оценки результатов применения методов ИФА-IgM и

ИФА-IgG для серологической диагностики лихорадки Западного Нила и ККГЛ.

Доказано значение вирусов денге, Чикунгунья, Западного Нила, москитных

лихорадок и лихорадки долины Рифт в этиологии случаев заболеваний у пациентов,

вернувшихся из тропических стран.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработаны и охарактеризованы иммуноферментные (ИФА) тест-системы

для выявления специфических IgM и IgG антител в сыворотках крови людей и об-

наружения антигенов вирусов: Синдбис и Чикунгунья (Togaviridae), Западного Ни-

ла, японского энцефалита, Желтой лихорадки, денге, Усуту, клещевого энцефалита

(Flaviviridae), ККГЛ, Тягиня, Инко, Батаи, Неаполитанской и Сицилийской москит-

ных лихорадок, Укуниеми, Бханджа (Bunyaviridae) и Дхори (Orthomyxoviridae); 2.

Разработаны и охарактеризованы ИФА тест-системы для выявления IgG антител к

вирусам Восточного, Западного и Венесуэльского энцефалитов лошадей в сыворот-

ках крови лошадей и к вирусам ККГЛ и Батаи в сыворотках крови овец.

3. Разработана новая технология приготовления пероксидазных конъюгатов

антител и антигенов на основе перйодатного метода (заявка на патент №

2012134015).

4. Впервые установлено значение вируса ЗН в этиологии крупной эпидеми-

ческой вспышки лихорадки ЗН в южном регионе России (Астраханская, Волгоград-

ская области и Краснодарский край) в 1999 г.

5. Изучена динамика специфических IgM и IgG антител в сыворотках крови

людей, больных ККГЛ и ЛЗН.

6. Выявлена связь между климатическими изменениями и расширением ареа-

ла вируса ККГЛ, что привело к появлению случаев этого заболевания на ранее не-

эндемичных территориях: в Волгоградской области (2000 г.), Калмыкии (2000 г.) и

Дагестане (2000 г.).

7. Установлено значение малоизученных арбовирусных инфекций: москит-

ных лихорадок Неаполь и Сицилия, Батаи, Укуниеми, Синдбис, Тягиня, Инко и

Бханджа в инфекционной патологии в России.

8

8. Впервые верифицированы и охарактеризованы случаи завозных тропиче-

ских и субтропических арбовирусных инфекций в РФ (лихорадка денге, лихорадка

Чикунгунья, лихорадка ЗН, неаполитанская москитная лихорадка и лихорадки до-

лины Рифт).

Личный вклад соискателя

Основные результаты диссертационной работы получены лично. Некоторые

разделы выполнены при участии сотрудников лаборатории биологии и индикации

арбовирусов ФГБУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского". Разработка и внед-

рение в лабораторную практику нового метода приготовления пероксидазных

конъюгатов проведена автором совместно с д.х.н. В.М. Шкиневым.

Обследование сывороток крови больных людей, доноров, а так же сывороток

крови животных и полевого материала проводились в лаборатории биологии и ин-

дикации арбовирусов НИИ вирусологии, а так же (при участии автора) в ЦГиЭ в г.

Астрахани, в "Причерноморской противочумной станции" г. Новороссийска и Со-

чинском отделении "Причерноморской противочумной станции" г. Сочи. Часть ис-

следований была выполнена в Волгоградском НИПЧИ Роспотребнадзора, Ставро-

польском НИПЧИ Роспотребнадзора, Ростовском ПЧИ Роспотребнадзора с исполь-

зованием авторских ИФА тест-систем.

Внедрение результатов исследований в практику

Шесть типов ИФА тест-систем для диагностики лихорадки ЗН и ККГЛ про-

шли успешные испытания в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича в 2004 г. и рекомендованы

Комитетом по иммунобиологическим препаратам для регистрации в РФ.

Авторские ИФА тест-системы для детекции специфических антител IgM и

IgG, а также антигена вируса ЗН сертифицированы в РФ и внедрены в производство

в ЗАО "Биосервис".

На базе лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии

сотрудниками Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумако-

ва и Государственного НИИ Биологического приборостроения проведены успеш-

ные лабораторные испытания ИФА тест-систем ЗАО "Биосервис" для диагностики

ККГЛ и КЭ.

На основании результатов проведенных исследований разработаны норма-

тивно регламентирующие документы: Методические рекомендации для врачей

"Клиническая характеристика вспышки нейроинфекции в Волгограде летом 1999

года и лечебно-диагностическая тактика ведения больных серозными менингитами"

(Волгоград 1999 г.); Методические указания (МУ 3.1.3.002-2000) "Эпидемиологиче-

9

ский надзор за лихорадкой Западного Нила в Астраханской области, специфическая

диагностика заболевания, меры общественной и личной профилактики" (Астрахань

2000 г.); Методические рекомендации "Мероприятия по борьбе с лихорадкой За-

падного Нила на территории Российской Федерации (Волгоград 2002 г.); Методиче-

ское пособие "Вирусы серогруппы калифорнийского энцефалита и вызываемые ими

заболевания: клинико-эпидемиологическая характеристика, географическое распро-

странение, методы вирусологической и серологической диагностики" (Москва

2003 г.); Учебно-методическое пособие для факультетов последипломного образо-

вания "Новые и возвращающиеся вирусные инфекции в системе биобезопасности

Российской Федерации" (Москва 2014 г.).

Методология и методы исследования

Методология проведенных исследований основывается на принципах и кри-

териях, установленных при анализе основополагающих литературных данных и ме-

тодических рекомендациях, посвященных вопросам конструирования диагностиче-

ских препаратов и их применения при изучении вопросов этиологии и эпидемиоло-

гии арбовирусных инфекций. Были использованы методы, широко применяемые во

всем мире: вирусологические - выделение вирусов на н.б.м. и перевиваемых куль-

турах клеток; классические серологические реакции - реакция нейтрализации, РСК,

РТГА; методы ИФА, МФА и ОТ-ПЦР.

Достоверность результатов

Достоверность результатов диссертации обеспечивается большим объемом

обследованных образцов - более 20000 сывороток крови людей и животных, а так

же комаров и клещей; проведением экспериментальной части работы на сертифи-

цированном оборудовании и многообразии использованных методов и эксперимен-

тов, обеспечивших современный научно-методический уровень; применением ста-

тистической обработки результатов.

Апробация диссертации

Результаты работы были представлены на симпозиумах и конференциях: In-

ternational Union Microbiological Societies Congress (Саппоро, Япония, сентябрь

2011), 1st International Conference on Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (Салоники,

Греция, февраль 2015), 2-ой научной конференции с международным участием

"Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и

Крайнего Севера" (Новосибирск, 2002), международном семинаре "Изменения кли-

мата и здоровье населения России в XXI веке" (Москва, 2004), 5-ой Всероссийской

научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных болезней"

10

(Москва, 2004), расширенном пленуме проблемной комиссии "Арбовирусы" и

научно-практической конференции "Арбовирусы и арбовирусные инфекции" (Аст-

рахань, 2006), 7-ой Всероссийской научно-практической конференции с междуна-

родным участием "Молекулярная диагностика" (Москва, 2007), IX съезде Всерос-

сийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и парази-

тологов (Москва 2007), X межгосударственной научно-практической конференции

"Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных

ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения госу-

дарств – участников СНГ" (Ставрополь, 2010), IV Ежегодном Всероссийском Кон-

грессе по инфекционным болезням (Москва, 2012).

Апробация диссертации состоялась на заседании Совета по предварительной

экспертизе

диссертационных

работ

ФГБУ

«НИИ

вирусологии

им.

Д.И.Ивановского» Министерства здравоохранения России по проблеме «Общая ви-

русология и инфекционные болезни» 30 июня 2014 г.

Публикации

Основные результаты диссертационной работы отражены в печати, в том

числе, в 28 статьях в отечественных рецензируемых журналах, входящих в Пере-

чень, рекомендованный ВАК, и двух публикациях в зарубежных журналах, индек-

сируемых в международных системах цитирования (библиографические базы - Web

of Science, Scopus, PubMed).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 288 страницах машинописного текста, состоит из

Введения, Обзора литературы, Собственных исследований, Выводов, списка лите-

ратуры, содержащего 650 источников, иллюстрирована 58 таблицами, 18 рисунка-

ми. Приложение к диссертации содержит список научно-технической документации

на ИФА тест-системы для диагностики лихорадки Западного Нила и Крымской-

Конго геморрагической лихорадки (Выписка из протокола №6 Комитета медицин-

ских иммунобиологических препаратов), Регистрационное удостоверение № ФСР

2012/13840 на Набор реагентов для выявления антигенов вируса Западного Нила и

антител к нему методом иммуноферментного анализа "БиоСкрин-ВЗН", Протокол

технических испытаний медицинского изделия – набор реагентов для выявления

антигенов вируса и антител к вирусу Крымской-Конго геморрагической лихорадки

методом иммуноферментного анализа "БиоСкрин-ККГЛ". В Приложение также

11

включены протоколы серодиагностических исследований и таблицы, содержащие

большой массив данных.

Гранты

Проведенные исследования частично были поддержаны грантами МНТЦ №

624, №2087, №2439 и №3404.

Результаты собственных исследований

1. Технология приготовления ИФА тест-систем для серологической диа-

гностики арбовирусных инфекций и детекции специфических вирусных анти-

генов.

1.1. Новый способ приготовления пероксидазных конъюгатов.

Конъюгаты с пероксидазой являются важным компонентом большинства ком-

мерческих иммуноферментных тест-систем. Наиболее распространенный на сего-

дняшний день метод конъюгации (мечения пероксидазой), с помощью перйодатного

окисления, предложен Nakane P. К. и Kawaoi A. (1974 г.).

Использованный в нашей работе новый способ приготовления пероксидазных

конъюгатов основывается на использовании нанотехнологических методов, в част-

ности, применении мембран с известной наноструктурой и размерами пор. Предло-

женная технология предусматривает замену диализа и хроматографии на ультра-

фильтрацию в ячейках. Ячейки представляют собой ёмкости разных объемов, в ко-

торых закрепляются полупроницаемые ультрафильтрационные мембраны. На 1-й

стадии (активации пероксидазы с помощью NaIO4) диализ или хроматография на ко-

лонке с носителем G-25, заменяется на фильтрацию через различные типы мембран

(например, полисульфоновые или ацетилцеллюлозные и т.п., а так же ядерные филь-

тры с порами различной формы (цилиндрические, конусообразные и т.п.)) с близким

размером пор. На 2-й стадии (образования конъюгата с альдегид-пероксидазой) диа-

лиз и хроматография на колонке с носителем –G-200, заменяется на фильтрацию че-

рез мембраны.

Ниже приводится пример определения активности конъюгатов пероксидазы с

антителами к вирусу ККГЛ в опытах ИФА по выявлению антигенов (АГ) вируса

ККГЛ (табл.1). Представленные результаты позволяют заключить, что в ИФА рабо-

чее разведение данной серии конъюгата составляет 1:400.

Построенный по результатам титрования в ИФА конъюгатов Батаи (сер.1 и 2)

с АГ вируса Батаи график зависимости ОП от разведения конъюгатов позволил

АГ*

ККГЛ

Серия 1

Разведения

конъюгата

1:50

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

1:3200

1:6400

Контроль

(бланк)

АГ ККГЛ

АГ N** (отрица-

Серия 2

тельный)

0.028

2.013

2.043

0.048

0.019

1.732

1.827

0.026

0.016

1.670

1.519

0.015

0.021

1.673

1.482

0.013

0.019

1.133

1.031

0.010

0.016

0.952

0.815

0.008

0.014

0.551

0.525

0.009

0.011

0.354

0.290

0.008

12

Таблица 1 Определение активности пероксидазного конъюгата антител к

вирусу ККГЛ в ИФА с антигеном вируса ККГЛ

*- разведения антигенов 1:100

**- АГ N – нормальный, не инфекционный антиген

определить точки "насыщения" реакции (начало ниспадающих трендов графиков)

для конъюгатов сер. 1 и 2 находится на уровне разведений 1:200 и 1:1600, соот-

ветственно (рис.1).

На новый мембранный способ получения пероксидазных конъюгатов пода-

на заявка на патент (№ 2012134015).

Мембранный способ имеет преимущество перед методом гельфильтрации,

заключающейся простоте технологии и экономичности, что даёт возможность по-

лучать высокоактивный и специфичный продукт как в препаративных, так и про-

мышленных количествах.

4

3,5

3

2,5

2

1,5

1

0,5

0

сер 1 с АГ Батаи

сер 1 с АГ N

сер 2 с АГ Батаи

сер 2 с АГ N

100

200

400

800

1600

3200

6400

12800

обратная величина титра

Рис.1. Зависимость ОП пероксидазных конъюгатов антител к вирусу Ба-

таи от разведения конъюгатов

13

2. Испытание и внедрение экспериментальных ИФА-тест-систем для

специфической диагностики ККГЛ и ЛЗН.

2.1. Сравнительные испытания ОТ-ПЦР тест-систем "Амплисенс

ККГЛ" (ЦНИИ эпидемиологии, Москва), "ГенКонго" (ПЧИ Микроб, Сара-

тов) и ИФА тест-системы для детекции вируса ККГЛ (лаб. биологии и инди-

кации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва) в кли-

нических и полевых материалах.

Настоящие испытания были проведены в 2006 г. на базе лаборатории биологии

и индикации арбовирусов с целью использования полученных результатов для Госу-

дарственной регистрации систем "АмплиСенс ККГЛ" и "ГенКонго".

В работе были использованы две экспериментально-производственные тест-

системы "АмплиСенс ККГЛ" (Центрального НИИ эпидемиологии, Москва) и "Ген-

Конго" (РОСНИПЧИ «Микроб») с праймерами, комплементарными к консерватив-

ной области гена S-сегмента вируса ККГЛ.

С целью определения сравнительной чувствительности и специфической ак-

тивности ИФА и ОТ-ПЦР тест-систем обследовали сыворотки крови больных с се-

рологически подтвержденным диагнозом ККГЛ, больных СПИДом, гепатитами В и

С и сыворотки крови от практически здоровых лиц, пробы клещей Hyalomma mar-

ginatum из Астраханской и Ростовской областей и клещей Ixodes persulcatus из

Пермской области, неэндемичной по ККГЛ.

Проведенные исследования показали, что испытанные серии ИФА и ПЦР тест-

систем, предназначенные для детекции вируса ККГЛ в экспериментальных, клини-

ческих и полевых материалах, обладают высокой специфичностью. При обследова-

нии экспериментальных вируссодержащих материалов чувствительность ПЦР си-

стемы "ГенКонго" оказалась равной чувствительности метода заражения нбм, детек-

ционная способность ПЦР системы "АмплиСенс" была более высокой. Чувствитель-

ность метода ИФА отставала всего на 1-2 порядка. При обследовании сывороток

крови больных ККГЛ, взятых в острый период болезни, наилучшие результаты были

показаны также с тест-системой "АмплиСенс". Результаты обследования проб кле-

щей H. marginatum – переносчиков вируса ККГЛ - в ИФА, "ПЦР АмплиСенс" и

"ПЦР ГенКонго" оказались близкими. Представленные данные указали на перспек-

тивность применения оригинальных отечественных ИФА и ПЦР тест-систем в науч-

ных целях, для экспресс-диагностики ККГЛ и изучения циркуляции вируса в энде-

мичных регионах.

14

2.2. Сравнительные испытания ИФА тест-систем ЗАО "ВекторБест"

(Новосибирск) и "ЛабБИА" "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского"

(Москва) для выявления специфических антител классов М и G и антигенов

вируса ККГЛ.

Данные испытания проводились в 2009 г. на базе лаборатории биологии и ин-

дикации арбовирусов по инициативе ЗАО "Вектор-Бест" и рекомендации Минздрава

РФ.

При сравнительном испытании ИФА-тест-систем «ВектоКрым-КГЛ-IgМ» и

«ЛабБИА-IgM-ККГЛ» были использованы следующие сыворотки крови: больных

ККГЛ, доноров из неэндемичного по ККГЛ региона, больных ЛЗН, КЭ, лихорадкой

неясной этиологии, пациентов, позитивных на IgM антитела к вирусу краснухи.

Результаты обследования в тест-системах «ВектоКрым-КГЛ-IgМ» и «ЛабБИА-

IgM-ККГЛ» контрольных сывороток оказались полностью отрицательными (100%

совпадения). Все сыворотки крови больных ККГЛ в тест-системах «ВектоКрым-

КГЛ-IgМ» и «ЛабБИА-IgM-ККГЛ» оказались положительными (совпадение резуль-

татов – 100%).

Анализ данных указал качественное совпадение результатов обследования

специфических и контрольных сывороток в IgМ-тест-системах ЗАО «Вектор-Бест» и

НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. Однако ряд сывороток больных ККГЛ с

высокой ОП в тест-системе ЛабБИА-IgM-ККГЛ были значительно менее активными

в наборах «Вектор-Бест», что, возможно, свидетельствует о ее более низкой чувстви-

тельности и, следовательно, меньшей эффективности при диагностике ККГЛ.

В процессе испытания ИФА-тест-систем «ВектоКрым-КГЛ-IgG» и «ЛабБИА-

IgG-ККГЛ» использовали сыворотки крови: больных ККГЛ, доноров, пациентов с

вирусным гепатитом В, больных ЛЗН, КЭ, больных с лихорадкой неясной этиологии,

пациентов, содержащие IgG к вирусу и пациентов из контрольной панели IgG ККГЛ

«Вектор-Бест».

Результаты обследования в тест-системах «ВектоКрым-КГЛ-IgG» и «ЛабБИА-

IgG-ККГЛ» всех контрольных сывороток оказались отрицательными (100% совпаде-

ния).

Полученные данные выявили близкое качественное и количественное совпа-

дение результатов обследования всех специфических и контрольных сывороток в

IgG-тест-системах ЗАО «Вектор-Бест» и НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского за

исключением четырех. Две сыворотки, "положительные" в тест-системе «Вектор-

15

Бест», в системе Института вирусологии оказались ложноположительными, так как

реагировали с контрольным (нормальным) антигеном. Сыворотки № 69 и 108, поло-

жительные в тест-системе Института вирусологии, были отрицательными в наборах

«Вектор-Бест». Три сыворотки больных ККГЛ с крайне слабой специфической ак-

тивностью IgG в наборах «Вектор-Бест», реагировали резко положительно с доста-

точно высокой ОП в системе «ЛабБИА-IgG-ККГЛ».

При испытании наборов для выявления антигенов вируса ККГЛ («ВектоКрым-

КГЛ-антиген» и «ЛабБИА-АГ-ККГЛ») в качестве тестируемых образцов использо-

вали суспензии иксодовых клещей, собранных в неэндемичном по ККГЛ регионе

России; суспензии иксодовых клещей, в которые был добавлен антиген вируса ККГЛ

в различных разведениях; суспензии органов (мозг, сердце, печень, селезенка, лег-

кое, почки) нормальных белых мышей; суспензии органов нормальных белых мышей

с внесенным антигеном вируса ККГЛ; несколько серий специфического антигена ви-

руса ККГЛ; контрольные пробы, содержащая антигены вирусов Тягиня, Инко и зай-

ца-беляка.

В результате испытаний в ИФА тест-системах ЗАО «Вектор-Бест» и НИИ ви-

русологии контрольных (отрицательных) и специфических (положительных) образ-

цов, было установлено полное качественное совпадение результатов обследования

всех 25 проб, заведомо содержащих антиген вируса ККГЛ. При титровании пяти ан-

тиген-содержащих проб были получены очень близкие количественные характери-

стики концентрации антигена ККГЛ. Совпадение результатов обследования 28 кон-

трольных материалов также оказалось практически полным (за исключением слабого

ложноположительного результата обследования суспензии клещей в тест-системе

«ВектоКрым-КГЛ-антиген»).

Общие результаты сравнительных испытаний ИФА трех типов тест-систем

двух производителей позволили сделать вывод об их пригодности для специфиче-

ской диагностики ККГЛ. Однако для подтверждения специфичности позитивных ре-

зультатов наборы ИФА-IgM и ИФА-IgG ЗАО "Вектор-Бест" необходимо обеспечить

отсутствующим в них контролем сывороток с нормальным антигеном, а наборы на

выявление антигена вируса ККГЛ – нормальным глобулином.

2.3. Государственные испытания экспериментальных ИФА тест-

систем НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского для выявления антител классов

М и G к вирусам ККГЛ и ЗН в сыворотках крови человека, так же антигенов

вирусов ККГЛ и ЗН в полевых материалах (ГИСК им. Тарасевича, 2003 г.).

16

2.3.1. ИФА тест-системы для диагностики ЛЗН.

Программа испытаний ИФА IgM (MAC-ELISA) включала обследование сле-

дующих групп зашифрованных сывороток крови: больных ЛЗН с подтвержденным

диагнозом; реконвалесцентов через год после перенесенной ЛЗН; доноров из энде-

мичной по ЛЗН Астраханской области; доноров из неэндемичного региона.

В ходе эксперимента было установлено, что количество положительных проб,

предоставленных для эксперимента, совпадает с количеством полученных положи-

тельных сигналов. После расшифровки опыта установлено 100% совпадение резуль-

татов. Совпадение результатов для трех серий наборов так же оказалось полным.

В процессе зашифрованных испытаний трех серий ИФА-IgG тест-систем были

обследованы следующие категории сывороток крови: больных ЛЗН с верифициро-

ванным диагнозом; реконвалесцентов через год после перенесенной ЛЗН; доноров из

эндемичного и неэндемичного по ЛЗН регионов.

В ходе расшифровки полученных результатов была установлена 100% адек-

ватность данных обследования положительных и отрицательных сывороток с ис-

пользованием всех трех серий ИФА-IgG наборов.

В программе испытаний ИФА тест-системы НИИ вирусологии для выявления

антигена вируса Западного Нила в полевых и клинических материалах были исполь-

зованы следующие материалы: комары, отловленные в очагах вируса ЗН; вируссо-

держащие образцы (культуральная жидкость клеточных культур и суспензии мозга

нбм); культуральная жидкость неинфицированных клеточных культур и суспензии

мозга нбм; суспензии мозга нбм, содержащие антигены гетерологичных арбовирусов

(ККГЛ, КСГ, Синдбис, Батаи, Дхори, Бханджа, Укуниеми); комаров, отловленных в

районах, неэндемичных по лихорадке ЗН.

В ходе испытаний установлено, что в ИФА тест-системе для выявления анти-

генов вируса ЗН не выявляются антигены гетерологичных арбовирусов, также отсут-

ствуют положительные результаты при обследовании суспензий комаров из неэнде-

мичных регионов. В то же время, были успешно определены все заведомо положи-

тельные зашифрованные образцы.

2.3.2. ИФА тест-системы для диагностики ККГЛ.

В соответствии с требованиями ГИСК для испытаний были предоставлены три

серии ИФА-IgM тест-систем и следующие группы сывороток крови людей: с вери-

фицированным диагнозом ККГЛ; доноров - жителей эндемичных по ККГЛ районов;

доноров – жителей неэндемичных территорий.

17

В результате проведенных зашифрованных исследований было установлено,

что в сыворотках крови больных, с установленным диагнозом ККГЛ на 9-20 день от

начала болезни в 97,1 % случаев, выявляются специфические IgM. Тест-система об-

ладает 100% специфичностью, т.к. результаты обследования сывороток крови доно-

ров оказались отрицательными. Полученные результаты были воспроизведены при

троекратной (в трех сериях наборов) постановке опытов ИФА-IgM.

Для испытаний ИФА-IgG тест-систем были предоставлены следующие группы

сывороток крови людей: больных с диагнозом ККГЛ; доноров - жителей регионов,

эндемичных и неэндемичных по ККГЛ регионов.

В результате испытаний было показано, что в сыворотках всех больных ККГЛ,

обследованных после третьей недели заболевания, присутствуют антитела класса G.

Среди сывороток доноров - жителей эндемичных по ККГЛ территорий – обнаружена

одна IgG позитивная проба (2%). У доноров из неэндемичного региона антитела не

выявлены.

Для определения чувствительности, специфичности ИФА тест-системы для

выявления антигенов вируса ККГЛ в полевых материалах и определения воспроиз-

водимости результатов использовали следующие материалы: вирус ККГЛ в виде

суспензии мозга мышей-сосунков (штамм «Узбекистан») с титром 6,8 lg LD50/0,1 мл;

штамм «Волгоград 29664» в виде инфицированной культуральной жидкости культу-

ры клеток SW-13 с титром 5,0 lg ЦПД50 /0,1 мл; инактивированные культуральные и

«мозговой» антигены вируса ККГЛ; суспензии мозга неинфицированных нбм; пробы

культуральной жидкости неинфицированных клеточных культур; - антигены гетеро-

логических вирусов (Западного Нила и Гета); пробы клещей, собранных в эндемич-

ных и неэндемичных по ККГЛ регионах.

При обследовании проб суспензий мозга мышей-сосунков, инфицированных

штаммами «Узбекистан» и «Волгоград 29664» вируса ККГЛ, антигены выявлялись в

разведениях 10-4 и 10-2 соответственно.

В результате испытаний было показано, что ИФА тест-система выявляет 103

доз LD50 в 0,1 мл вируса ККГЛ. Титр инактивированного антигена ККГЛ был равен

1:32000. Контрольные (нормальные) культуральные или «мозговые» антигены, а так

же антигены гетерологичных вирусов при постановке в испытуемой тест-системе не

реагировали. При обследовании 75 пулов клещей H. marginatum, собранных в энде-

мичном по ККГЛ регионе, в 5 пулах была выявлена позитивная ИФА-реакция, тогда

как результаты обследования 30 пулов из неэндемичного региона были отрицатель-

ными. Воспроизводимость тест-системы подтверждена при трехкратном повторном

18

тестировании 5 антигенпозитивных и 5 негативных материалов.

2.3.3. Заключение Комитета медицинских иммунобиологических

препаратов.

В результате проведенных Государственных испытаний ИФА тест-систем

НИИ вирусологии для выявления антител классов М и G к вирусам ККГЛ и ЗН в сы-

воротках крови человека, так же антигенов вирусов ККГЛ и ЗН в полевых материа-

лах, Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов было вынесено ре-

шение : "Считать целесообразным рекомендовать к регистрации в РФ следующих

тест-систем:

для выявления антител класса G к вирусу ККГЛ;

для выявления антител класса М к вирусу ККГЛ;

для выявления антигена вируса ККГЛ;

для выявления антител класса G к вирусу ЗН;

для выявления антител класса М к вирусу ЗН;

для выявления антигена вируса ЗН (Выписка из протокола №6 от 26.06.2003 г.)

2.4. Испытание и внедрение в практику ИФА тест-систем с ЗАО "Биосер-

вис", основанных на использовании специфических компонентов производства

"НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского".

Медицинские испытания комплектов «М» и «G» включали: образцы сыворо-

ток крови больных с острыми лихорадочными заболеваниями и образцы сывороток

здоровых доноров из эндемичных регионов, сыворотки здоровых доноров из неэн-

демичного региона, образцы, содержащих IgM-антитела к вирусам ККГЛ, краснухи и

цитомегаловирусу.

IgМ и IgG антитела к ВЗН были выявлены у 20,8% больных острыми лихора-

дочными заболеваниями из Ростовской области. Антитела IgG были обнаружены

также в 2-х образцах сывороток крови здоровых доноров из Астраханской области.

Среди котрльных групп сывороток IgM и IgG антитела к вирусу ЗН обнаруже-

ны не были.

Медицинские испытания комплекта «AG» включали обследование 5649 кома-

ров и 2484 клещей, собранных в эндемичной по ЛЗН Астраханской области, а так же

комаров и клещей из неэндемичных регионов.

В пять из 92 пулов комаров из Ленинградской области был добавлен антиген

вируса ЗН (штамм Аст 986) в разведении 1:1000, в 5– антиген вируса Синдбис, в 5 –

антиген вируса Батаи, в 5 – антиген вируса Укуниеми. В 5 из 42 обследуемых пулов

клещей из Пермской обл. был добавлен антиген вируса ККГЛ в разведении 1:1000.

19

Все 5 проб с добавленным антигеном ВЗН оказались положительными. Все

образцы с антигенами гетерологичных вирусов - отрицательными.

При обследовании 254 пулов суспензий комаров из Астраханской обл. в 4

пробах выявлены антигены ВЗН в титрах от 1:40 до 1:320.

Все остальные пробы, включающие комаров и клещей из неэндемичных реги-

онов и клещей из Астраханской области, оказались отрицательными.

Чувствительность наборов была исследована на 5 зашифрованных образцах

пулов суспензий комаров с внесенным антигеном ВЗН. Титр вируса во всех этих

пробах составлял ≥ 1:16000.

Воспроизводимость результатов трех производственных серий составила

100%.

По результатам Медицинских испытаний опытно-производственных серий

наборов реагентов «БиоСкрин-ВЗН» комплекты «М», «G» и «АG» было сделано за-

ключение о том, что изделие медицинского назначения "БиоСкрин-ВЗН" комплекты

«G», «М» и «AG» для выявления антигена вируса ЗН и антител к нему может быть

представлено к регистрации в Российской Федерации.

3. Приготовление экспериментальных ИФА тест-систем для использова-

ния в практических лабораториях РФ в 1999-2009 гг.

На основе технологической методологии, в лаборатории биологии и индика-

ции арбовирусов были созданы ИФА тест-системы для выявления антигенов и серо-

логической диагностики заболеваний, вызываемых вирусами Синдбис, Чикунгунья,

денге, желтой лихорадки, ЗН, КЭ, японского энцефалита, Батаи, Бханджа, Калифор-

нийской серогруппы, ККГЛ, лихорадки долины Рифт, Укуниеми, Дхори.

Официальные положительные отзывы, касающиеся применения ИФА тест-

систем для серодиагностики ККГЛ и лихорадки ЗН, были получены в 2001-2003 гг.

из ряда практических учреждений: ФГУ ЦГиЭ в Астраханской области, ФГУ ЦГиЭ в

Волгоградской области, ФГУ ЦГиЭ в Краснодарском крае и Дагестанской ПЧС. Во

многих публикациях региональных учреждений санитарно-эпидемиологической

службы страны также были отражены данные успешного применения этих систем в

практических целях. В период с 1999 по 2009 г.г. практически вся серологическая

диагностика ККГЛ, лихорадки Западного Нила и других (малоизученных) арбови-

русных инфекций в РФ основывалась на применении экспериментальных ИФА тест-

систем, производимых в лаборатории биологии и индикации арбовирусов.

На протяжении 11 лет на двусторонних договорных условиях с диагностиче-

скими лабораториям (в ФКУЗ ЦГиЭ Астраханской, Волгоградской, Вологодской,

20

Ростовской, Мурманской, Ульяновской областей, Краснодарского края, Республики

Коми; ФКУЗ ПЧС Астраханской и Читинской областей, Новороссийска, Хабаров-

ского края и Калмыкии; НИПЧИ Волгограда, Саратова, Иркутска и Ставрополя;

КДЦ Екатеринбурга, КИБ Перми, ЦИБ Махачкалы, Омского НИИПОИ, ЦСПИД

Красноярска, НИИЭМ СО РАМН Владивостока, НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН Иркутска)

было предоставлено более 4000 ИФА-тест-систем: 2074 для выявления специфиче-

ских IgM в сыворотках крови больных людей, 911 для выявления IgG и 1117 для де-

текции антигенов эндемичных арбовирусов.

3.1. Использование экспериментальных ИФА тест-систем НИИ вирусо-

логии им. Д.И. Ивановского для серологической диагностики лихорадки За-

падного Нила (1997-2006 гг).

3.1.1. Астраханская область.

В летне-осенние месяцы 1997-2006 гг в вирусологической лаборатории ЦГиЭ

Астраханской области методом ИФА IgМ (MAC-ELISA) на антитела к вирусу ЗН

было обследовано 10065 сывороток крови 5610 больных острыми лихорадочными

заболеваниями. Лабораторно верифицировано 339 случаев лихорадки ЗН. Большая

часть IgM-позитивных сывороток дополнительно обследовались нами для определе-

ния титров специфических IgМ и IgG антител. При этом данные, полученные в виру-

сологической лаборатории ЦГиЭ в Астраханской области, и наши результаты совпа-

дали практически полностью.

В 1999 и 2005 гг., когда наблюдались наиболее высокие показатели заболевае-

мости ЛЗН (соответственно 95 и 73 случаев), частота верификации диагноза ЛЗН

достигала максимального уровня - 18,8 и 21,9%.

Наибольшее число больных было зарегистрировано в г. Астрахани (204), а из

сельских районов области - в Приволжском (43), Наримановском (35), Икрянинском

(23) и Красноярском (12).

3.1.2. Расшифровка этиологии эпидемической вспышки лихорадки Запад-

ного Нила на юге Европейской части России в 1999.

С июля по сентября 1999 г. в Волгоградской, Астраханской областях и Крас-

нодарском крае наблюдалась крупная вспышка заболеваний, протекающих, главным

образом, как серозный менингит и менингоэнцефалит. 10 парных сывороток боль-

ных детей, госпитализированных в лечебные учреждения Волгограда с симптомами

менингоэнцефалита, лихорадкой и сыпью на коже, были обследованы нами в ИФА

на антитела классов M и G к вирусам ЗН, Синдбис, ККГЛ и Тягиня - эндемичными

Обратная величина титров антител*

IgM к вирусам

IgG к вирусам

боль-

ного

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Про

бы

I**

II

I

II

I

II

I

II

I

II

Синд-

бис

Синд-

бис

ЗН

800

800

800

800

800

800

800

800

800

800

ККГЛ Тягиня

ЗН

ККГЛ Тягиня

0

0

0

н/и***

н/и

н/и

н/и

0

0

0

3200

0

0

0

0

0

0

н/и

н/и

н/и

н/и

0

0

0

3200

0

0

0

0

0

0

н/и

н/и

н/и

н/и

0

0

0

3200

0

0

0

0

0

0

н/и

н/и

н/и

н/и

0

0

0

6400

0

0

0

0

0

0

н/и

н/и

н/и

н/и

0

0

0

6400

0

0

0

0

0

0

н/и

н/и

н/и

н/и

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

н/и

н/и

н/и

н/и

0

0

0

3200

0

0

0

0

0

0

н/и

н/и

н/и

н/и

0

0

0

6400

0

0

0

0

0

0

н/и

н/и

н/и

н/и

0

0

0

3200

0

0

0

0

0

0

н/и

н/и

н/и

н/и

0

0

0

400

0

0

0

21

для Нижнего Поволжья и вызывающими схожую симптоматику. Все обследованные

сыворотки содержали антитела к вирусу ЗН. Полученные результаты четко свиде-

тельствовали о значении вируса ЗН в этиологии этих случаев. Антитела к вирусам

Синдбис, ККГЛ и Тягиня в тех же сыворотках отсутствовали (табл.2).

Таблица 2 Результаты обследования сывороток крови больных детей с

диагнозом менингоэнцефалит из Волгоградской области в ИФА на IgM и IgG

антитела к вирусам ЗН, Синдбис ККГЛ и Тягиня

I

0

II

800

I

II

I

II

I

II

I

II

800

800

800

800

800

800

200

800

* - первое разведение сывороток 1:100;

** - интервал между взятием сывороток во всех случаях не превышал 3-4 дней.

*** - сыворотка не обследовалась

С целью дополнительного подтверждения роли вируса ЗН в возникновении

эпидемической вспышки серозного менингита и менингоэнцефалита 28 сыворо-

ток крови от 15 больных лихорадкой ЗН из Волгоградской области были обследо-

ваны в РТГА с антигеном вируса ЗН (штамм 1628), антигенами родственных ему

флавивирусов: японского энцефалита (штамм Р1), желтой лихорадки (штамм Да-

22

кар) и альфавируса Синдбис (штамм 574). В 26 (92,9%) из 28 сывороток были об-

наружены антигемагглютинины к вирусу ЗН, в 10 (35,7%) - к вирусу ЯЭ, в 25

(89,3%) - к вирусу ЖЛ, при отсутствии антител к вирусу Синдбис. Средние гео-

метрические титров антигемагглютининов к вирусам ЗН, ЯЭ и ЖЛ в положитель-

ных сыворотках составили 2,70,09 lg, 1,50,08 lg и 2,20,07 lg соответственно.

Статистически различия между этими показателями были достоверны (p0,001 во

всех случаях).

Таким образом, резкое преобладание титров специфических антигемагглю-

тининов и IgM антител к вирусу ЗН подтвердило роль вируса Западного Нила в

этиологии заболеваний у обследованных больных из Волгоградской области.

3.1.3. Эффективность применения методов MAC-ELISA, ИФА-IgG и

РТГА для диагностики лихорадки ЗН.

К концу 1999 г. методом ИФА на IgM и IgG к вирусу ЗН, а также в РТГА

нами были обследованы сыворотки крови 605 больных с подозрением на лихо-

радку ЗН, полученные из Волгоградской области (120 проб), Астраханской обла-

сти (427) и Краснодарского края (38 проб), а также 21 проба СМЖ от 21 больных

из Волгоградской области и Краснодарского края. Результаты тестирования сыво-

роток и проб СМЖ тремя использованными методами (ИФА-IgM, ИФА-IgG и

РТГА) совпали практически полностью (табл.3).

При этом, частота подтверждения диагноза «лихорадка Западного Нила»

составила: по Волгоградской области – 84,1% (106 случаев из 126 обследован-

ных), по Астраханской области – 22,3% (95 из 427), по Краснодарскому краю –

77,4% (41 из 53), а среди больных с клиническими диагнозами «менингит» и «ме-

нингоэнцефалит» (в целом по трем территориям) – 80%.

IgM антитела к вирусу ЗН в титрах 1:10-1:320 были обнаружены в 16 из 21

обследованных пробах СМЖ. 200 сывороток крови и 12 образцов ликвора от

больных из Волгоградской области, из числа серопозитивных на антитела к виру-

су ЗН, были обследованы в лаборатории геморрагических лихорадок Института

полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (заведующий -

Е.А. Ткаченко) на антитела к вирусам ГЛПС и лимфоцитарного хориоменингита с

отрицательными результатами.

23

Таблица 3 Серологическая диагностика лихорадки Западного Нила в юж-

ном регионе Европейской части России в 1999 году

Результаты обследования сывороток крови и проб ликвора боль-

ных на антитела к вирусу ЗН.

ИФА-IgM

ИФА-IgG

РТГА

Всего

605

242

363

203

165

38

203

165

38

242

* - параллельное обследование сывороток крови методами ИФА (на IgM и IgG ) и РТГА;

** - обследование проб СМЖ только в ИФА-IgM

*** - обследование сывороток крови только в ИФА на антитела IgM.

3.1.4. Итоговые данные о заболеваемости лихорадкой ЗН в Южном ре-

гионе в 1999 г.

Наличие в лаборатории широкого спектра диагностических ИФА-тест-систем

позволило в 1999 г. впервые установить значение вируса ЗН в этиологии эпиде-

мии лихорадки ЗН в южном регионе России (Астраханская, Волгоградская обла-

сти и Краснодарский край). В ходе этой вспышки методом ИФА, в наборах про-

изводства НИИ вирусологии было обследовано 1262 больных и подтверждено 560

случаев лихорадки ЗН: в Астраханской области – 95 (погибло 5 человек (5,3%)),

Волгоградской области – 380 (погибло 38 человек (10%)) и Краснодарском крае –

85 (0 погибших).

3.1.5. Динамика титров специфических IgM, IgG, выявляемых метода-

ми ИФА, и антигемагглютининов в сыворотках крови больных лихорадкой

ЗН

В результате обследования 143 сывороток крови больных, перенесших лихо-

радку ЗН в 1999 г. в Волгоградской области, установлено, что специфические IgМ

область

6**

Астраханская

45*

область

381***

Краснодарский

38*

край

15**

45

38

6

0

36

9

59

322

31

7

10

5

106

95

41

Волгоградская

120*

100

20

120

99

21

120

99

21

35

10

45

35

10

31

7

38

31

7

24

антитела к вирусу ЗН появляются уже в первые 2-3 дня заболевания. Их титры

быстро возрастают и достигают высокого уровня (иногда до 1:204800) на 11-15

дни от начала болезни. Максимальные уровни IgG и антигемагглютининов отста-

вали от IgM антител на 3-4 дня, достигая пика на 16-18 день. При этом средний

уровень IgM антител был выше на всем протяжении наблюдения.

3.1.6. Персистенция специфических антител у реконвалесцентов, пере-

несших лихорадку Западного Нила.

Для изучения динамики М и G антител к вирусу ЗН в период поздней рекон-

валесценции (через 6-7 месяцев после заболевания) в Волгоградской области была

обследована группа из 40 человек. У всех из них в августе-сентябре 1999 г. диа-

гноз Л3Н был установлен на основании выявления в сыворотке крови специфиче-

ских IgM-антител к вирусу ЗН в титрах 1:800 и выше. При раститровке сывороток

у 18 из этих 40 больных были обнаружены высокие титры IgM, как правило, от

1:6400 до 1:204800 (таб. 20). У 35 больных были выявлены также специфические

IgG в титрах от 1:800 до 1:12 800, а у 18 (из 18 обследованных) - антигемагглюти-

нины в титрах от 1:40 до 1:1280.

В сыворотке крови тех же 40 человек, обследованных в мае-июне 2000 г. (че-

рез 6-7 мес. после перенесенного заболевания), IgM-антитела к вирусу ЗН отсут-

ствовали (при разведении сывороток 1:50), а IgG были обнаружены у 35 (87,5%)

человек. У 33 больных, обследованных с положительным результатом осенью

1999 г. и затем в мае-июне 2000 г., была отмечена следующая динамика G-

антител: исчезновение (отрицательный результат обследования сывороток в раз-

ведении 1:50) у 6 человек, снижение титра в 2-4 раза у 10, в 8-32 раза у 10, сохра-

нение титра у 4, увеличение титра в 2-4 раза у 3 человек.

В мае-июне 2001 г., через 1,5 года после перенесенного заболевания, IgG-

антитела к ВЗН были обнаружены у 23 (88,5%) из 26 обследованных реконвалес-

центов. У 19 из них сохранились те же титры IgG, а у 4 антитела не были обнару-

жены, как и в мае-июне 2000 г.

По данным обследования 16 больных ЛЗН в пробах крови, взятых во время

болезни осенью 1999 г. и в мае-июне 2000 г., антигемагглютинины к вирусу ЗН

сохранялись в течение 6-7 мес. При этом снижение титров антител наблюдалось у

10 человек, из них снижение в 4-8 раз - у 4, примерно одинаковые титры сохраня-

лись - у 5; увеличение титра - у 1. В общей сложности в мае-июне 2000 г. в РТГА

25

с положительным результатом были исследованы сыворотки крови 37 реконва-

лесцентов, переболевших ЛЗН в 1999 г.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что в условиях эндемич-

ных регионов юга европейской части России при серологическом обследовании

лихорадящих больных с подозрением на ЛЗН методом MAC-ELISA диагностиче-

ское значение имеет выявление в крови специфических IgM в титрах 1:50 и выше.

У реконвалесцентов, перенесших ЛЗН в течение предшествующего эпидемиче-

ского сезона (июль-октябрь), М-антитела к вирусу ЗН полностью исчезают, по-

этому положительный результат МАС- ELISA, полученный при исследовании

сывороток (или одной сыворотки), взятых у больного в первые недели заболева-

ния, свидетельствует о недавно приобретенной инфекции.

Как видно из представленных данных, антигемагглютинины к вирусу ЗН со-

храняются не менее 7 месяцев у всех реконвалесцентов, а специфические G-

антитела – в течение 1,5 лет наблюдения у подавляющего большинства (88%), хо-

тя и с выраженным падением титров.

В случае применения этих двух реакций (ИФА-IgG и РТГА) для подтвержде-

ния острых случаев ЛЗН диагностическое значение может иметь только обнару-

жение выраженной сероконверсии при обследовании парных сывороток (появле-

ние антител во второй пробе, 4-кратное или более выраженное нарастание или

снижение титров во второй пробе по сравнению с первой).

3.1.7. Волгоградская область.

В рамках совместных исследований с медицинскими учреждениями Волго-

града серологическая диагностика лихорадки ЗН с использованием ИФА тест-

систем НИИ вирусологии проводилась с 1999 по 2006 гг. За этот период в Волго-

градской области было верифицировано 452 случая ЛЗН, в том числе 380 (84.0%)

в 1999 г., 32 (7.0%) в 2000 г., по 15 (3.3%) в 2001 и 2002 гг., 3 (0.7%) в 2005 г. и 7

(1.5%) в 2006 г.

В результате ретроспективного обследования сывороток больных менинго-

энцефалитом, хранившихся в ЦГиЭ в Волгоградской области, методом ИФА-IgM

было выявлено 5 больных ЛЗН в 1997 и 35 – в 1998 гг.

3.1.8. Ростовская область.

Процент под-

тверждения диа-

гноза ЛЗН (%)

2,1

2,2

0

1,5

3,5

6,4

3,3

Обследовано

Верифицировано

больных

случаев ЛЗН

Годы

2000

2001

2002

2003

2004

2005

324

226

95

129

196

247

7

5

0

3

7

18

40

26

Вирусологическая лаборатория ЦГСЭН в Ростовской области проводила

серологическое обследование больных с подозрением на лихорадку ЗН с тест-

системами НИИ вирусологии с 2000 по 2005 г.г. (табл.4).

За этот период в области было верифицировано 40 случаев ЛЗН. Относи-

тельное увеличение числа заболевших, как и в Астраханской области, отмечалось

в 2005 г.

Таблица 4 Серологического диагностика лихорадки ЗН в Ростовской

области методом ИФА-IgM (2000 – 2005 гг.)

Всего

1217

3.1.9. Краснодарский край

В 1999 г. в Краснодарском крае было выявлено 85 случаев заболеваний ли-

хорадкой ЗН, в 2000 г. – 13. В 2003 г. при обследовании 98 больных с лихорадкой

неясной этиологии из района Большого Сочи было верифицировано 4 случая ли-

хорадки ЗН. У 66 обследованных лихорадящих больных из Краснодара лихорадки

ЗН обнаружено не было. В 2005 г. в результате обследования 15 больных с пред-

варительным диагнозом лихорадка ЗН из Новороссийска диагноз был подтвер-

жден в 12-ти случаях. В 2007 году было выявлено 8 больных лихорадкой ЗН сре-

ди 186 обследованных жителей Сочи (72) и Краснодара (114). Все эти 8 пациентов

были жителями Краснодара. В 2008 г. среди 211 обследованных больных с диа-

гнозом лихорадка неясной этиологии из Новороссийска и Сочи случаев ЛЗН не

обнаружено.

3.1.10. Использование ИФА тест-систем для изучения иммунострукту-

ры населения Астраханской области к вирусу ЗН.

310 сывороток практически здоровых людей, собранных в 1998 г., были об-

следованы в ИФА-IgG, 142 из них – в ИФА-IgM, 240 – в РН на культуре клеток

27

Vero E6 и 258 в РТГА. 162 сыворотки, взятые в 1999 г. были обследованы в РН,

ИФА-IgG и ИФА-IgM и 159 из них – в РТГА.

Среди сывороток 1998 г. 63 (26,3%) оказались положительными в РН, 84

(27,1%) - в ИФА-IgG и 20 (7,8%) - в РТГА. IgM к вирусу ЗН не обнаружены ни в

одной из 142 обследованных проб. Общее число серопозитивных доноров по дан-

ным трех реакций составило 98 (31,6%).

В сыворотках, собранных в июле-октябре 1999 г., вируснейтрализующие

антитела были обнаружены в 72 случаях (44,4%), специфические антитела класса

IgM – в 5 (3,1%), иммуноглобулины класса G - в 44 (27,1%) и антигемагглютини-

ны в 11 (6,9%). Число положительных находок по результатам обследования в че-

тырех реакциях в 1999 г. составило 81 (50,0%).

Сыворотки крови трех доноров из пяти, позитивных в 1999 г. на IgM к ви-

русу ЗН, были положительными также в РН, ИФА-IgG и РТГА, у одного из них

обнаружены вируснейтрализующие антитела и IgG; и у одного – только вирус-

нейтрализующие.

Общие результаты обследования сывороток, собранных в Астраханской об-

ласти в 1998 и 1999 г.г., оказались следующими: из 402 проб, обследованных в

РН, положительными были 135 (33,6%), 5 из 304 (1,6%) оказались положитель-

ными на IgM, 128 из 472 (27,1%) – положительными на IgG и 31 из 417 (7,4%) –

реагировали в РТГА. После эпидемической вспышки ЛЗН 1999 г., по сравнению с

1998 г., произошло увеличение серопозитивных лиц с 31,6% до 50,0% (p0,001), в

основном, за счет возрастания (на 18,1%) числа доноров, серопозитивных в РН с

вирусом ЗН (рис.2).

Подтверждением активности эпидемического процесса в июле-октябре

1999 г. явилось обнаружение IgM к вирусу ЗН у 5 из 162 (3,1%) жителей г. Астра-

хани, обследованных осенью 1999 г., что свидетельствует о недавно перенесенной

иннапарантной форме ЛЗН. Сравнение этих данных с относительным показателем

заболеваемости на 100000 населения по г. Астрахани и области (12,2) позволило

определить примерное соотношение манифестных и иннапарантных форм ЛЗН в

1999 году как 1:250.

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0

27,1

1998

1999

Рис.2. Выявление антител к вирусу Западного Нила в сыворотках крови доно-

ров из Астраханской области до и после эпидемической вспышки 1999 года в РН,

ИФА-IgМ, ИФА-IgG и РТГА

3.1.11. Применение ИФА тест-системы для выявления антигенов вируса

ЗН в полевых материалах.

Наиболее активные работы по выявлению антигенов вируса ЗН в комарах с

использованием наших ИФА-тест-систем на выявление антигенов проводились в

Волгоградской области с 1999 по 2005 гг. При обследовании в ИФА 32223 экземпля-

ров кровососущих комаров (1522 пробы), относящихся к 5 родам, антигены вируса

ЗН были обнаружены в 35 пробах: в 23 пробах C.pipiens, добытых в подвалах жилых

домов гг. Волгограда, Волжского, Камышина, Михайловки, поселка Светлый Яр, в 3

пробах C. modestus, отловленных в открытых стациях Среднеахтубинского и Светло-

ярского районов, в 6 пробах A. maculipennis, доставленных из Октябрьского, Михай-

ловского и Новоанненского районов области, а также в 3 пробах Ae. vexans, пойман-

ных в г. Волгограде и Светлоярском районе.

Результаты применения ИФА-тест-систем показали преобладание находок ан-

тигенов вируса ЗН в комарах рода Culex, обитающих в подвалах жилых домов. Это

совпадает с эпидемиологическими данными о преобладании заболеваемости лихо-

радкой ЗН среди городского населения Волгоградской области.

3.1.12. Методические рекомендации по диагностике лихорадки ЗН.

На основании проведенных исследований была определена оптимальная схема

проведения лабораторной диагностики лихорадки ЗН, сформулированная нами в Ме-

тодических рекомендациях, и предусматривающая:

7,8

3,1

0

РН

ИФА IgM

ИФА IgG

РТГА

6,9

28

44,4

27,1

26,3

29

1) Обнаружение вирусной РНК, антигенов вируса ЗН, выделение вируса из

клинических материалов (ОТ-ПЦР, ИФА, заражение мышей и культуры клеток) - до

5 дня от начала болезни;

2) Обнаружение специфических IgM антител в сыворотках крови и СМЖ

(ИФА-IgМ) – от 3 дня болезни;

3) Применение ИФА-IgG и РТГА в качестве необязательных подтверждающих

методов, требующие обследования парных сывороток (начиная с 5-7 дня от начала

болезни).

С целью обнаружения циркуляции вируса ЗН в природе рекомендуется обсле-

довать органы птиц, суспензии комаров и преимаго иксодовых клещей методами за-

ражения нбм и клеточных культур, ОТ-ПЦР и ИФА.

3.2. Использование экспериментальных ИФА тест-систем НИИ вирусоло-

гии им. Д.И. Ивановского для серологической диагностики ККГЛ.

3.2.1. Астраханская область.

За период с 1997 по 2006 годы в Астраханской области вирусологами ЦГиЭ

методом MAC-ELISA на антитела класса М к вирусу ККГЛ было обследовано 5610

больных острыми лихорадочными заболеваниями (10065 сывороток). Лабораторно

верифицирован 101 случай ККГЛ.

Число больных варьировало по годам от одного-трех в 1997, 1999, 2004 г.г. до

11, 12, 16 и 37 в 2001, 2002, 2006 и 2005 г.г. Частота подтверждения диагноза при об-

следовании сывороток крови лихорадящих больных колебалась от 0,2 – 0,3% (в 1997,

1999, 2004 г.г.) до 7,9 – 11,1% (в 2006 и 2005 г.г.) при среднем показателе 1,8%.

3.2.2. Ростовская область

За период с 2000 по 2005 гг. в Ростовской области вирусологами ЦГиЭ с ис-

пользованием наборов ИФА-IgМ производства НИИ вирусологии было обследовано

1379 больных с подозрением на ККГЛ.

Лабораторно верифицировано 46 случаев ККГЛ. В 2000 г. больных ККГЛ об-

наружено не было. В последующие годы число выявленных случаев распределилось

следующим образом: 5 в 2001 г., 7 в 2002 г., 9 в 2003 и 2004 гг. и 16 в 2005 г. Частота

подтверждения диагноза при обследовании сывороток крови лихорадящих больных в

2005 г. составила 8,3% при среднегодовом показателе 3,3%.

3.2.3. Волгоградская область

В результате использования наших ИФА-IgM тест-систем в 2000 г. на терри-

тории Волгоградской области сотрудниками ЦГиЭ были впервые верифицированы

30

случаи ККГЛ. За период 2000 по 2006 гг. было выявлено 57 случаев заболеваний:

2000 г. – 18; 2001 г. – 9; 2002 г. – 3; 2003 г. – 3; 2004 г. – 2; 2005 г. – 6; 2006 г. – 16.

3.2.4. Использование ИФА-IgG тест-систем для выявления антител к ви-

русу ККГЛ в сыворотках крови населения Волгоградской области.

Сыворотки крови (641 проба), взятые в 2002 г. у жителей 7 сельских районов

области в 2002 г., были обследованы в ИФА на IgG антитела к вирусу ККГЛ. 11 сы-

вороток из этого числа были взяты у реконвалесцентов, перенесших ККГЛ в 2001-

2002 г.г. Все они оказались положительными. В остальных 630 пробах IgG к вирусу

ККГЛ не были обнаружены. Эти данные подтвердили выраженную специфичность

используемых ИФА-IgG тест-систем и позволили сделать вывод об отсутствии гумо-

рального иммунитета к ККГЛ у жителей области, не имеющих в анамнезе указаний

на перенесенное ранее заболевание.

3.2.5. Применение ИФА тест-систем НИИ вирусологии для изучения цир-

куляции вируса ККГЛ и специфической диагностики инфекции на территории

Черноморского побережья Кавказа.

С целью изучения циркуляции вируса ККГЛ на территории Черноморского

побережья Кавказа в 2004 году нами методом ИФА было обследовано 5820 экзем-

пляров (168 проб) иксодовых клещей, собранных в Сочинском районе Краснодарско-

го края сотрудниками Сочинского отделения Причерноморской ПЧС. Антигены ви-

руса ККГЛ были обнаружены в двух пробах (1,1%) клещей Boophilus annulatus, кро-

ме того антигены вируса Дхори (сем. Orthomyxoviridae) – в двух пробах (1,1%) кле-

щей рода Dermacentor.

В период с 2000 до 2005 гг. в ходе совместных исследований с сотрудниками

Причерноморской ПЧС нами было обследовано 880 сывороток, собранных в весен-

не-летний период, от 849 лихорадящих больных методом ИФА-IgM на наличие анти-

тел класса М к вирусу ККГЛ. В результате этой работы серологически был верифи-

цирован один случай ККГЛ, который является первым на Российской территории

Черноморского побережья Кавказа и первым случаем ККГЛ, диагностированным в

Краснодарском крае за последние 57 лет.

3.2.6. Определение титров специфических антител классов М и G у боль-

ных ККГЛ.

С целью определения титров антител классов М и G к вирусу ККГЛ и оптиче-

ской плотности сывороток в зависимости от их разведения нами было обследовано в

ИФА 29 сывороток от больных ККГЛ из Астраханской и Волгоградской областей,

собранных весной-летом 2003 годам.

31

Было установлено, что титры специфических М и G антител в сыворотках

больных ККГЛ могут достигать максимальных значений 1:102400. Позитивные сы-

воротки крови больных можно разделить на три группы: «сильные» (от 1:25600 и

выше), средней активности (от 1:1600 до 1:12800) и «слабые» (от 1:100 до 1:800). В

некоторых сыворотках с высоким содержанием М и G антител обнаруживается эф-

фект «прозоны», когда ОП в начальных разведения сыворотки ниже чем в последу-

ющих. В ИФА-IgM пик "прозоны" (наивысшее значение ОП для сыворотки при ее

титровании) приходится на разведение 1:200 для 4-х из пяти сывороток и 1:400 для

одной.

В ИФА-IgG пик "прозоны" приходится на разведение 1:800 для 3-х из четырех

сывороток и 1:1600 для одной. В ИФА-IgM эффект "прозоны" проявляется для 100%

сывороток с титром антител 1:102400 (4 сыворотки) и для 25% сывороток с титром

антител 1:51200 (1 из 4 сывороток).

3.2.7. Влияние климата на активность и распространение очагов ККГЛ в

северном регионе ареала вируса.

С 1891 по 1973 г.г. в Астраханской и Ростовской областях наблюдалось общее

потепление климата, причина чего, вероятно, заключалась в смене основных типов

циркуляции атмосферы в атлантико-евразийском секторе северного полушария. За

этот период значительные потепления в течение двух или трех лет подряд имели ме-

сто в 1920-1921, 1950-1951, 1962-1963, 1966-1968 г.г. В 1950-1953 г.г. заболевания

ККГЛ впервые появились в Астраханской области, а в 1963 – в Ростовской (где вы-

сокие температуры апреля и мая в 1950-51 г.г. сочетались с суровыми зимами).

Экстремально холодные зимы приводят к длительному снижению эпидемиче-

ской напряженности очагов, что выражается в последующем многолетнем отсут-

ствии, или очень низкой заболеваемости. В Астраханской области такая ситуация

наблюдалась в 1956-1957 г.г. Благоприятные условия сохранения зимующих в почве

клещей в 1962 г. и последующие 6 лет привели к резкому ухудшению эпидситуации:

с 1962 по 1968 г.г. ККГЛ в области заболели 184 человека (в среднем 26,2 случая за

сезон).

Зимой 1968-1969 г.г. морозы начались рано, достигали -29 С0 и сохранялись в

пределах -200 и ниже в течение более 2 месяцев. Вследствие этого, средний индекс

пораженности коров имаго H. marginatum, составляющий 20 в 1968 г., упал в мае

1969 г. менее чем до 0,1 и заболевания ККГЛ летом 1969 г. не отмечались. Начиная с

1995 г., в течение шести лет подряд отмечались мягкие зимы, а среднесезонные ин-

дексы обилия H. marginatum возросли к 2000 г. до 3,8, что привело к повышению

32

уровня заболеваемости ККГЛ в 2001, 2002 и 2003 г.г., когда было выявлено, соответ-

ственно, 11,12 и 9 больных.

Вспышки ККГЛ в 2000-2004 г.г. были зарегистрированы впервые в Волгоград-

ской области, Калмыкии и Дагестане.

Появление ККГЛ в Волгоградской области представляет особый интерес, так

как данный факт свидетельствует о расширении ареала инфекции в результате по-

тепления климата.

3.3. Использование ИФА тест-систем для диагностики малоизучен-

ных арбовирусных заболеваний на территории России.

К данной группе относятся лихорадки Синдбис и Карельская, вызываемые

альфавирусами, буньявирусные лихорадки Тягиня, Инко, зайца беляка или Хатанга,

Батаи, неаполитанская и сицилийская москитные лихорадки, Укуниеми, Бханджа,

Дхори и Кемеровская. Вирус Дхори относится к семейству Orthomyxoviridae, вирус

Кемерово – к семейству Reoviridae.

3.3.1. Серологическая диагностика малоизученными арбовирусных ин-

фекций с использованием ИФА-IgM тест-систем (MAC-ELISA).

3.3.1.1. Астраханская область

Начиная с 1997 г., работа по изучению заболеваемости малоизученными арбо-

вирусами проводилась нами совместно с ФГУ Роспотребнадзора Астраханской обла-

сти, ЦГиЭ в Астраханской области и Областной инфекционной больницей г. Астра-

хани, ФГУ Роспотребнадзора и ЦГиЭ в Волгоградской области, а так же с проти-

вочумными станциями в Новороссийске и С.-Петербурге. Серологическое обследо-

вание больных с острыми лихорадочными заболеваниями неясной этиологии прово-

дилось с экспериментальными тест-системами лаборатории биологии и индикации

арбовирусов.

В результате этой работы в 1997-2010 гг. в Астраханской области было выяв-

лено 35 случаев арбовирусных инфекций, связанных с вирусами Тягиня – 12, Инко –

5, с недифференцированным вирусом группы калифорнийского энцефалита – 3,

Синдбис – 7; Батаи – 6, Бханджа – 2, Укуниеми – 8, Сицилийской москитной лихо-

радки – 2 и Неаполитанской москитной лихорадки – 1 (табл.5). Как правило, диагно-

зы этих больных были: лихорадка неясной этиологии и астраханская риккетсиозная

лихорадка.

* - С 2006 года исследования проводились на поливалентных ИФА тест-системах с применением иммуноглобулинов, полученных из группоспецифичных ИАЖ

мышей, иммунизированных вирусами Инко, Тягиня и зайца-беляка.

** - не обследовались

12

0

0

0

0

0

0

0

1

1

0

0

0

0

0

0

0

2

3

1

0

0

0

1

0

1

0

0

0

0

1

7

годы

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

Всего

н.о.

н.о.

224

258

166

574

228

317

151

70

103

417

370

417

лихорадка

лихорадка

Сицилия

Неаполь

н.о.**

н.о.

224

258

138

н.о.

н.о.

317

н.о.

н.о.

н.о.

н.о.

н.о.

н.о.

0

369

0

302

0

827

4

649

5

986

2

962

1

964

0

715

0

421

0

3

0

0

0

369

535

827

1024

986

1064

964

888

421

227*

447

417

370

417

369

495

827

649

706

962

964

801

н.о.

227

447

417

370

417

количество обследованных больных

2

338

0

338

0

н.о.

н.о.

1

827

0

827

0

н.о.

н.о.

2

649

0

649

0

н.о.

н.о.

0

545

0

545

0

н.о.

н.о.

0

962

1

962

0

н.о.

н.о.

0

964

0

964

0

н.о.

н.о.

0

458

0

531

0

н.о.

н.о.

0

н.о.

н.о.

н.о.

н.о.

0

н.о.

н.о.

438

0

438

0

н.о.

н.о.

227

0

227

0

447

5

405

0

405

0

405

0

417

0

417

0

417

0

417

0

370

0

370

4

370

1

370

0

417

0

417

4

417

1

417

1

5

6

8

2

1

Бханджа

Дхори

Таблица 5 Серодиагностика малоизученных арбовирусных инфекций в Астраханской области (1997 - 2010

г.г.) с использованием ИФА-IgM тест-систем НИИ вирусологии

Москитная Москитная

Синдбис

Тягиня

Инко

Батаи

Укуниеми

Дата забо-

Место прожива-

Даты обсле-

Диагноз при

Титр Ig M к

вирусу Батаи

1:32000

исход заболе-

вания

выписан

13.08.2007 г.

выписан

24.08.2007 г.

выписан

13.08.2007 г.

выписан

29.08.2007 г.

Больные

левания

ния

дования

поступлении

менинго-

энцефалит

Харабалинский

район

С.Р. 75 лет

17.07.

27.07.2007 г.

23.08.2007 г.

28.07.2007 г.

21.08.2007 г.

16.08.2007 г.

К.М. 30 лет

7.08.

г. Астрахань

ОРВИ

1:800

Харабалинский

район

г. Астрахань

г. Астрахань

34

3.3.1.2. Случаи лихорадки Батаи.

В 2007 г., совместно с ЦГСЭН с использованием ИФА-IgM тест-систем

было верифицировано 5 случаев лихорадки Батаи в Астраханской области

(табл.6).

Таблица 6 Данные о больных лихорадкой Батаи в Астраханской обла-

сти (2007 г.)

М.У. 59 лет

28.07.

Т.Д. 32 год

11.08.

Т.М. 18 лет

23.07.

1:1600

1:1600

1:800

скончался

Представляют интерес результаты обследования больной С.Р. Титр специфи-

ческих антител класса М в ее сыворотке, взятой на 11 день заболевания, составил

1:32000 при отсутствии антител класса G. Результат обследования этой пробы мето-

дом непрямой флюоресценции оказался положительным, а титр в РСК составил

1:80. Во второй сыворотке С.Р., взятой через 5 месяцев после начала заболевания,

антитела класса М к вирусу Батаи отсутствовали, а титр IgG был 1:12800.

3.3.1.3. Новороссийский район Краснодарского края.

В 2009 и 2010 г.г. нами методом ИФА было обследовано соответственно 230

и 287 сывороток крови лихорадящих больных на антитела к вирусам Синдбис, Чи-

кунгунья, Бханджа, Укуниеми, Батаи, Калифорнийской серогруппы, москитных ли-

хорадок (Сицилия, Неаполь, Тоскана) (табл.7).

В 2009 г. IgM антитела обнаружены у двух больных (к вирусу Бханджа и

Москитной лихорадке Сицилия). В 2010 г. М антитела обнаружены к вирусам Уку-

ниеми, Москитной лихорадки Сицилия (по одному больному) и Калифорнийской

группы (2 больных). Случаи заболевания лихорадкой Бханджа и Укуниеми прихо-

дятся на весну, что обусловлено клещевой передачей этих вирусов. Заболевания,

связанные с вирусами калифорнийской серогруппы, и, передающиеся комарами,

приходятся на летне-осенний период. Заболевания москитной лихорадкой Сицилия

лихорадка неяс-

ной этиологии

менинго-

энцефалит

вирусный ме-

нингит

дата

день

заболе-

болез-

Антигены вирусов

вания

ни

2009 год

Боль

сыв.

ные

8

Cа.

обратная величина тит-

ра IgM антител

18.03

02.05

17.05

13.07

01.09

30.05

22

Бханджа

12 800

28

29

56

153

220

1

4

3

8

7

3

отр.

102 400

МЛ Сицилия

2010 год

Бр.

П.

Са.

Крд.

35

как в 2009, так и в 2010 гг. отмечались в мае. Все выявленные больные находились в

стационарах Новороссийска с диагнозом лихорадка неясной этиологии.

Таблица 7 Серологическая диагностика малоизученных арбовирусных

инфекций в Новороссийском районе Краснодарского края (2009 и 2010 гг.) с

использованием ИФА-IgM

Укуниеми

1 600

12 800

800

Калифорнийской

серогруппы

63

Сы.

МЛ Сицилия

1 600

3.3.2. Использование тест-систем ИФА-IgG для изучения иммунострук-

туры населения эндемичных территорий к малоизученным арбовирусам.

3.3.2.1. Астраханская область.

В 1998, 1999 и 2001 гг. было обследовано 2739 сывороток доноров на IgG ан-

титела к вирусам Синдбис, Батаи, Тягиня, Инко, Укуниеми, Бханджа и Дхори. Ре-

зультаты обследования с антигенами вирусов Бханджа и Дхори оказались отрица-

тельными. Обнаружены IgG антитела к вирусам Тягиня (14,7%), Инко (10,9%),

Синдбис (0,8 - 2,9 %), Батаи (2,7 - 5,8%) и Укуниеми (2,7 - 3,2 %)

3.3.2.2. Волгоградская область.

В 2001 и 2002 годах 232 сыворотки доноров из г. Волжский Волгоградской

области были обследованы в ИФА-IgG на антитела к вирусам Синдбис, Батаи, Тя-

гиня, Инко, Укуниеми, Бханджа и Дхори. Антитела к вирусу Синдбис были обна-

ружены у 3 человек, к вирусу Инко – у 17, к вирусу Батаи – у двух, к вирусу Укуни-

еми – у трех.

3.3.2.3. Краснодарский край

Среди 700 сывороток крови доноров, полученных из района Большого Сочи в

2001 и 2003 годах, были обнаружены IgG антитела к вирусам Синдбис(2,0%), Батаи

36

(2,4%), Тягиня (3,0%), Инко (1,5%) и Укуниеми (1,3%) (табл.59). Результаты обсле-

дования сывороток доноров жителей Большого Сочи, как и населения Астраханской

и Волгоградской областей, на антитела к вирусам Бханджа и Дхори оказались отри-

цательными.

Обнаружение специфических антител класса G свидетельствует о достаточно

активной циркуляции малоизученных арбовирусов на обследованных территориях

Нижней Волги и Краснодарского края. Полученные данные хорошо коррелируют с

результатами серологической диагностики у больных лихорадками неясной этиоло-

гии. Факт циркуляции вируса Батаи (штамм 42) в Волгоградской области подтвер-

ждается выделением нами этого агента в 2003 году (Отчет по гранту МНТЦ № 2087

за VI квартал (январь – март 2003 г.)).

3.4. Использование ИФА-IgG тест-систем для обнаружения антител к ви-

русам Батаи, ЗН и американских энцефалитов лошадей у сельскохозяйствен-

ных животных.

В результате обследования 140 сывороток крови овец, собранных в 2007 г. в

шести районах Астраханской области, антитела к вирусу Батаи были обнаружены в

4 пробах (12,5%) из Харабалинского района.

Территориальное распределение находок антител к вирусу Батаи, по резуль-

татам обследования 163 сывороток овец из Ставропольского края (2008 г.) оказа-

лись более равномерными. Антитела были обнаружены в Нефтекумском (6,9%),

Курском(25,0%), Благодарненском (1,6%) и Александровском (57%) районах.

ИФА тест-системы, предназначенные для обследования сывороток лошадей,

были использованы нами для выявления IgG антител к вирусам ЗН, Восточного

(ВсЭЛ), Венесуэльского (ВЭЛ) и Западного (ЗЭЛ) энцефалитов лошадей, импорти-

руемых в Россию из стран Северной и Южной Америки. Эта работа на протяжении

нескольких лет проводилась по договору с Волгоградским конным заводом. У им-

портированных животных различных групп с различной частотой выявляются спе-

цифические антитела ко всем перечисленным вирусам, эндемичным для многих ре-

гионов Америки, что связано с применением специфических вакцин или с предше-

ствующим естественным инфицированием.

В процессе этой работы в 2012-2013 г.г. были обследованы сыворотки крови

75 лошадей. Для примера приводятся данные обследования 30 сывороток. IgG ан-

титела к вирусу ЗН обнаружены у 21 лошади (70,0%), к вирусам ЗЭЛ и ВсЭЛ – у 15

37

(50,0%), к вирусу ВЭЛ – у 5 (16,7%). Выявление антител к вирусам ЗЭЛ и ВсЭЛ у

одних и тех же животных, возможно, связано с перекрестными реакциями между

этими антигенно-родственными вирусами.

4. Завозные случаи арбовирусных инфекций в Российскую Федерацию.

В результате серологического обследования 225 пациентов с острыми лихо-

радочными заболеваниями неясной этиологии, госпитализированных в 2003-2013

г.г. в лечебные учреждения Москвы и других городов России, после посещения

тропических и субтропических стран, было верифицировано 125 случаев лихорадки

денге, 10 случаев лихорадки Чикунгунья, 4 случая лихорадки Западного Нила и 3

случая неаполитанской москитной лихорадки (всего 143 случая).

Случаи лихорадки денге были связаны с посещением Таиланда (62), Индоне-

зии (30), Индии (8), Вьетнама (7), Мальдивских островов (6), Доминиканской Рес-

публики (4), Коста-Рики (2) и Венесуэлы (2), Сингапура (1), Шри-Ланки (1), Малай-

зии (1), Китая (о. Хайнань) (1).

Больные лихорадкой Чикунгунья возвратились в Россию после посещения

Индонезии (4), Мальдивских островов (3), острова Реюньон (1), Индии (1) и Таи-

ланда (1).

Заражение лихорадкой Западного Нила произошло в Индии, Индонезии, Ко-

ста-Рики и Венесуэле (по одному случаю), а больных москитной лихорадкой на ост-

ровах Средиземного моря - Мальта, Майорка и Кипр.

Наибольшее число обследованных больных пришлось на 2012-2013 г.г. Рас-

пределение 125 диагностированных случаев лихорадки денге оказалось следую-

щим: 2002 г. – 3, 2006 – 1, 2007 – 2, 2008 – 3, 2009 – 8, 2010 – 17, 2011 – 22, 2012 –

35, 2013 – 34. Больные лихорадкой Чикунгунья были выявлены в 2006 (1), в 2009

(6), в 2011 (1) и в 2012 г.г. (2); больные лихорадкой ЗН – в 2003, 2007, 2010 и 2011

г.г. (по одному случаю); больные москитной лихорадкой – в 2009, 2010 и 2011 г.г.

(по одному).

Из 143 проанализированных случаев завозных арбовирусных инфекций в

зимние месяцы (декабрь, январь, февраль) был выявлен 41 больной лихорадкой ден-

ге и 2 больных лихорадкой Чикунгунья (30,0%); в марте, апреле и мае – 29 случаев

денге, 2 случая Чикунгунья и 2 – лихорадки Западного Нила (23,1%); в июне, июле

и августе – 22 случая лихорадки денге, 2 случая москитной лихорадки и по одному

случаю лихорадок Западного Нила и Чикунгунья (18,2%), в сентябре, октябре и но-

25

20

15

10

5

0

денге

ЗН

Чикунгунья

Моск. лих.

Рис.3. Сезонное распределение верифицированных завозных случаев арбови-

русных инфекций

Наибольшее число случаев (16,1%) заболеваний приходится на январь месяц,

что, очевидно, связано с массовым выездом туристов в тропические страны во вре-

мя Новогоднего периода каникул и отпусков, так как пляжный отдых доступен в это

время только в регионах эндемичных по тропическим лихорадкам.

Среди больных с подтвержденными диагнозами лихорадка денге, лихорадка

Чикунгунья, лихорадка ЗН и неаполитанская МЛ был 61 мужчина и 82 женщин в

возрастных группах 20-30 лет (81), 31-40 лет (38), 41-50 лет (15), 55-60 лет (6), а так

же два ребенка в возрасте 10 и 15 лет с диагнозом лихорадка денге.

У 102 из 125 больных лихорадкой денге наблюдалась лейкопения (81,6%), у

94 (75,2%) – тромбоцитопения, у 84 (67,2%) – сыпь, у 51 (40,8%) – лимфаденопатия,

у 7 (5,6%) – суставные боли. В десяти случаях (8,0%) отмечались симптомы гемор-

рагической лихорадки денге: симптом жгута, кровоточивость десен, носовые крово-

течения и петехиальная сыпь. Геморрагический синдром наблюдался у пациентов,

вернувшихся из Индонезии (5), Таиланда (2), Мальдивский островов (2) и Коста-

Рики (1). Лихорадочный период составлял, в среднем, 5,8 суток с максимальной

температурой тела 40,0 С.

38

ябре – 33 случаев лихорадки денге, 5 случаев лихорадки Чикунгунья, 1 случай ли-

хорадки ЗН и 1 случай москитной лихорадки (27,9%) (рис.3).

0

39

У всех 10 больных лихорадкой Чикунгунья выявлялась сыпь, у шести (60,0%)

– лимфаденопатия, у 4-х (40,0%) – суставные боли, у 4-х (40,0%) – лейкопения и у

4-х (40,0%) – тромбоцитопения. Лихорадочный период составлял, в среднем, 5,6

суток с максимальной температурой 39,7 С.

При лихорадке ЗН имела место лейкопения (во всех 4 случаях), тромбоцито-

пения (у трех больных), сыпь (в двух случаях), лимфаденопатия (у одного). Лихора-

дочный период составлял, в среднем, 5,7 суток, максимальная температура 39,8 С.

В двух выявленных случаях неаполитанской МЛ из трех наблюдалась сыпь, у

одного больного – лейкопения, у другого – тромбоцитопения. Лихорадочный пери-

од продолжался 3 дня, с максимальной температурой 38,3 С.

Исходя из представления о распространении арбовирусных инфекций по зем-

ному шару, сыворотки тестировались на М антитела против вирусов, которые воз-

можно циркулируют в регионе, откуда прибыл турист. Для этого использовались

ИФА тест-системы для выявления антител к вирусам ЗН, Чикунгунья, денге (с ис-

пользованием смеси четырех типов антигенов) и москитных лихорадок, а для диа-

гностики лихорадки Долины Рифт использовали МФА.

Лихорадка Чикунгунья и Москитные лихорадки однозначно выявлялась ла-

бораторно при помощи ИФА тест-систем для выявления антител класса М (IgM).

Антитела появлялись на 3-5 дни заболевания, достигая высоких титров на 10-12 дни

болезни. G антитела появлялись только на второй неделе, достигая пика на 3-4 не-

деле. Перекрестного взаимодействия ни М, ни G антител к вирусу Чикунгунья в

тест-системах для диагностики широко распространенного вируса Синдбис (сем.

Togaviridae, род Alfavirus, антигенный комплекс Западного энцефалита лошадей) не

обнаружено.

Лабораторная диагностика флавивирусных инфекций (в эту группу кроме ли-

хорадки ЗН и Денге так же входят эпидемически значимые инфекции: Желтая лихо-

радка и Японский энцефалит) является более сложной проблемой из-за выраженно-

го перекрестного взаимодействия антител.

Использование метода MAC-ELISA позволяет уверенно дифференцировать

заболевание лихорадкой ЗН.

Было установлено, что титры сывороток в тест-системе на выявление антител

класса М к вирусу Западного Нила в 5-10 раз выше титров этих же сывороток в

тест-системах к вирусам денге, японского энцефалита (ЯЭ) и желтой лихорадки

(ЖЛ).

0

0

0

40

В то же время, при наличии только одного вида тест-систем (например, к ви-

русу денге) будут выявляться М антитела к вирусу денге, что приведет к непра-

вильной постановке диагноза (рис.4).

100

90

80

70

60

ЗН

50

Денге

40

ЯЭ

30

ЖЛ

20

10

0

Рис.4. Титы IgM антител у больных лихорадкой Западного Нила к вирусам Запад-

ного Нила, Денге, Японского энцефалита и Желтой лихорадки

В дальнейшем мы установили зависимость величины оптической плотности

(ОП) в начальных разведениях сывороток (например, 1:100) и конечного их титра

(последнего разведения, когда сыворотка еще является положительной).

Рис.5. Зависимость ОП в начальных разведениях сывороток крови больных

лихорадкой денге от титра антител в этих же сыворотках в ИФА тест-системе

(MAC-ELISA) к вирусу денге

ОП в начальных разведениях сывороток коррелирует с титрами этих сыворо-

ток (постоянно повышающийся тренд, обозначенный красной линией на рисунке

17), что дало возможность не использовать титрование сывороток для верификации

диагноза (рис.5). Коэффициент корреляции составляет 0.94 – это достаточно боль-

Сыв. 4 (лих. ЗН

юг Росии, 1999)

Сыв. 5 (лих. ЗН

юг России, 1999)

1

2

3

сыворотоки больных ЛЗН из тропических стран

ЗН

ЯЭ

ЖЛ

номера

сывороток

1,5

1

0,5

0

61 65 63 66 68 69 71 72 74 76 77 79 81 83 84 85 86 87 88 89 90

41

шое значение, которое с высокой надёжностью позволяет использовать для диагно-

стики только значение ОП без дополнительного определения титра.

В большинстве случаев применение панели ИФА-IgM наборов для диагно-

стики лихорадок Денге, Желтой, Западного Нила и Японского энцефалита позволи-

ло установить причину заболевания - лихорадка денге (рис.6).

3

ОП

2,5

2

денге

Рис.6. Значения оптических плотностей сывороток в четырех ИФА тест-

системах на выявление антител классов М к вирусам денге, Западного Нила, жел-

той лихорадки и японского энцефалита у больных лихорадкой денге: ОП критиче-

ское – значение оптической плотности (0,35), ниже которого сыворотка счита-

ется отрицательной.

Данные рис.6 иллюстрируют возможность применения панели из четырех

ИФА-IgM наборов для выявления антител. Диагностика лихорадки денге основыва-

ется на значительном превышении ОП сывороток в наборе ИФА-IgM-денге ОП этих

же сывороток в трех других наборах. В целом, обследованные сыворотки крови

имеют достоверно более высокие значения оптической плотности в ИФА для инди-

кации специфических IgM против вируса денге по сравнению с вирусами ЗН, ЯЭ

или ЖЛ.

Сыворотки больных под номерами 61, 65, 69, 88, 90 формируют группу, в ко-

торой преобладание М антител к вирусу денге не столь выражено, а в сыворотке

№88 ОП и титры против Денге и Западного Нила одинаковые. Возможно, это связа-

42

но с предшествующим перенесенным флавивирусным заболеванием или вакцина-

цией от Желтой лихорадки. Например, у больного №88 в первой сыворотке не было

М антител, но выявлялись антитела класса G к вирусам денге и Западного Нила в

равных титрах и в меньших к японскому энцефалиту и Желтой лихорадке.

Выводы

1. Разработаны, охарактеризованы, стандартизированы и нашли практическое

применение следующие иммуноферментные (ИФА) тест-системы: а) для выявления

специфических IgM и IgG антител в сыворотках крови людей к вирусам Синдбис и

Чикунгунья (сем. Togaviridae), Западного Нила, японского энцефалита, Желтой ли-

хорадки, денге, Усуту, клещевого энцефалита (сем. Flaviviridae), ККГЛ, Тягиня, Ин-

ко, Батаи, Неаполитанской и Сицилийской москитных лихорадок, Укуниеми, Бхан-

джа (сем. Bunyaviridae) и Дхори (сем. Orthomyxoviridae); б) для серологической

идентификации штаммов и обнаружения антигенов перечисленных эндемичных и

актуальных для РФ тропических арбовирусов в экспериментальных, клинических и

полевых материалах; в) для выявления IgG антител к вирусам Восточного, Западно-

го и Венесуэльского энцефалитов лошадей (сем. Togaviridae) в сыворотках крови

лошадей; г) для выявления IgG антител к вирусам ККГЛ и Батаи в сыворотках кро-

ви овец.

2. Авторские ИФА тест-системы для детекции специфических IgM, IgG антител

и антигенов вирусов ККГЛ и Западного Нила прошли успешные испытания в ГИС-

Ке им. Л.А. Тарасевича и рекомендованы к регистрации в РФ Комитетом медицин-

ских иммунобиологических препаратов.

3. На ИФА тест-системы для специфической диагностики ЛЗН (ИФА-IgM,

ИФА-IgG и ИФА-антиген ЗН) в 2012 г. получено Регистрационное удостоверение

(ФСР 2012/13840), в соответствии с чем, они разрешены к применению на террито-

рии РФ и внедрены в коммерческое производство ЗАО "Биосервис".

4. Установлено, что тест-системы ИФА производства НИИ вирусологии для

детекции антигенов вируса ККГЛ и ОТ-ПЦР тест-системы ("Интерлабсервис" и

ПЧИ "Микроб"), предназначенные для детекции РНК вируса ККГЛ, обладают вы-

сокой специфичностью. Чувствительность ИФА при обследовании эксперименталь-

ных вируссодержащих материалов оказалась ниже, чем ОТ-ПЦР на 1-2 порядка, хо-

тя, результаты тестирования этими методами проб клещей H. marginatum – перенос-

чиков вируса ККГЛ оказались близкими, что указывает на перспективность приме-

нения авторских ИФА тест-систем для изучения циркуляции вируса в эндемичных

43

регионах.

5. В течение 1999 – 2009 гг. в ходе работы по обеспечению ИФА тест-

системами для серологической диагностики заболеваний, вызываемых вирусами

Синдбис, Чикунгунья, ЗН, КЭ, денге, японского энцефалита, желтой лихорадки, Тя-

гиня, Инко, зайца-беляка, Батаи, ККГЛ, Укуниеми, Дхори, Бханджа в практические

и научные лаборатории РФ были предоставлены 2074 набора для выявления специ-

фических IgM в сыворотках крови больных людей, 911 - для выявления IgG и 1117 -

для детекции антигенов арбовирусов. Альтернативные препараты для диагностики

этих инфекций (за исключением КЭ, ЛЗН и ККГЛ) в настоящее время отсутствуют.

6. Разработана новая технология приготовления пероксидазных конъюгатов

антител и антигенов на основе перйодатного метода.

7. В результате обследования большого числа сывороток крови людей, боль-

ных ККГЛ и ЛЗН изучена динамика специфических IgM и IgG антител и рекомен-

дована используемая в настоящее время тактика и критерии серологической диа-

гностики этих заболеваний.

8. Применение авторских ИФА-тест-систем позволило в 1999 г. впервые

установить значение вируса ЗН в этиологии эпидемии ЛЗН в южном регионе Рос-

сии (Астраханская, Волгоградская области и Краснодарский край), в 2010 г. – рас-

шифровать этиологию вспышки ЛЗН в Воронежской области, а так же верифициро-

вать первые случаи ККГЛ в Волгоградской области (2000 г.), Калмыкии (2000 г.) и

Дагестане (2001 г.), что явилось доказательством значительного расширения ареала

этих тяжелых заболеваний. В период с 1997 по 2010 г.г. в практических лаборатори-

ях РФ с использованием экспериментальных ИФА тест-систем НИИ вирусологии

было верифицировано 1558 случаев ЛЗН и 1384 случаев ККГЛ.

9. Использование авторских ИФА тест-систем позволило верифицировать де-

сятки случаев малоизученных арбовирусных инфекций: Синдбис, Батаи, Тягиня,

Инко, москитных лихорадок Неаполь и Сицилия (впервые в РФ), Укуниеми, и

Бханджа (также впервые в РФ).

10. Впервые в России в результате применения ИФА-IgM и ИФА-IgG тест-

систем для серологической диагностики завозных случаев тропических и субтропи-

ческих арбовирусных инфекций в 2004 – 2013 г.г. было выявлено 125 случаев лихо-

радки денге, 10 случаев лихорадки Чикунгунья, 4 случая ЛЗН, 3 – неаполитанской

москитной лихорадки и по одному случаю ЛДР и японского энцефалита.

11. При проведении серологической диагностики случаев тропических арбо-

вирусных инфекций существует необходимость комплексного (параллельного) об-

44

следования сывороток крови больных людей на IgM антитела (методом MAC-

ELISA) к вирусам денге, Западного Нила, японского энцефалита, желтой лихорадки,

Чикунгунья и москитных лихорадок с учетом ареала этих инфекций, сложностью

дифференциации этиологически родственных флавивирусных инфекций и гетеро-

генных заболеваний близких по клиническим проявлениям.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Львов Д.К. Выделение вируса лихорадки Западного Нила от больных людей в

период эпидемической вспышки в Волгоградской и Астраханской областях /

А.М. Бутенко, О.И. Вышемирский, С.И. Гайдамович, В.Л.Громашевский, В.Ф.

Ларичев, Т.Н. Морозова // Вопросы вирусологии. – 2000. – № 3. –С. 9-12.

2. Бутенко А.М. Эпидемиологическая характеристика лихорадки Западного Нила в

астраханской области / А.И. Ковтунов, А.Ф. Джаркенов, Л.В. Злобина, А.П.

Гришанова, А.Р. Азарян, В.Ф. Ларичев, Е.О. Шишкина, Д.К. Львов // Вопросы

вирусологии. – 2001. – Т. 46. – № 4. – С. 34-35.

3. Краснова Е.М. Эпидемиологический мониторинг лихорадки Западного Нила в

Волгоградской области / Д.К. Львов, А.Н. Жуков, Л.В. Штром, Н.В. Русакова,

Г.И. Фролова, А.Ю. Фролов, Н.В. Хуторецкая, В.Ф. Ларичев, М.Ю. Щелканов,

А.М. Бутенко // Вопросы вирусологии. – 2001.– Т. 46. – № 4. – С. 27-31.

4. Прилипов А.Г. Анализ новых вариантов вируса Западного Нила / А.Г. Прилипов,

Р.М. Кинней, Е.И. Самохвалов, Г.М. Сэвадж, С.В. Альховский, К.Р. Цучия, В.Л.

Громашевский, Г.К. Садыкова, А.Г. Шаталов, О.И. Вышемирский, Е.В. Усачев,

В.В. Мохонов, А.Г. Воронина, А.М. Бутенко, В.Ф. Ларичев, А.Н. Жуков, А.И.

Ковтунов, Д.Ж. Гублер, Д.К. Львов // Вопросы вирусологии – 2002. – №4. – С.36-

41.

5. Деконенко Е.П. Тяжелая форма энцефаломиелита, вызванная вирусом Западного

Нила / Ларичев В.Ф., Бутенко А.М., Зоринев А.Б., Малышев Н.А. // Неврологи-

ческий журнал. – 2002. – №6. – Т 7. – С.19-22.

6. Ларичев В.Ф. Показатели специфических антител у реконвалесцентов, пере-

несших

лихорадку

Западного

Нила

/

А.М.

Бутенко,

Н.В.

Русакова,

Л.В.Шишкина, А.Н. Жуков, Е.О. Шишкина, Д.К. Львов // Вопросы вирусологии.

– 2002. – №6. – С.11-13.

7. Шишкина Е.О. Изучение иммуноструктуры населения Астраханской области к

вирусу Западного Нила в 1998 и 1999 г.г. / А.М. Бутенко, С.Я. Гайдамович, В.Ф.

45

Ларичев, В,И. Журавлев, С.А. Щербакова, А.И. Ковтунов, А.Ф. Джаркенов, В.Г.

Ситков, М.Г. Донская // Вопросы вирусологии. – 2002. – №6. – С.13-17.

8. Писарев В.Б. Морфофункциональная характеристика антигенпрезентирующих

клеток лимфатических узлов мышей при экспериментальном воспроизведении

лихорадки Западного Нила / Е.О. Шишкина, В.Ф. Ларичев, Н.В. Григорьева //

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. – №3. – Т.135. – С.

339-342.

9. Ковтунов А.И. Заболеваемость и заражаемость населения Астраханской области

лихорадкой Западного Нила в 2002 г. / Л.В. Колобухина, Т.М. Москвина, Е.О.

Шишкина, А.Ф. Джаркенов, Л.Б. Кистенева, Д.Н. Львов, М.Ю. Щелканов, В.А.

Аристова, В.Ф. Ларичев, Л.В. Злобина, А.П. Гришанова, Е.П. Гренкова, Т.Е.

Аршба, Ю.В. Оганесян // Вопросы вирусологии. – 2003. – Т.48. – №5. – С. 9-11.

10.Писарев В.Б. Гепатотропное действие вируса лихорадки Западного Нила / А.М.

Бутенко, В.А. Петров, Н.В. Григорьева, В.Ф. Ларичев // Вопросы вирусологии. –

2005. – № 1. – С. 37-38.

11.Писарев В.Б. Морфологические и иммуногистохимичес-кие изменения в ткани

легких, миокарда и почек при экспериментальной лихорадке Западного Нила /

А.М. Бутенко, В.А. Петров, Н.В. Григорьева, В.Ф. Ларичев // Вопросы вирусо-

логии. – 2005. – №2. – С. 37-38.

12.Найденова Е.В. Тест-система для выявления РНК вируса Крымской-Конго ге-

моррагической лихорадки методом ОТ-ПЦР / И.Н. Шарова, С.А. Щербакова,

Ю.И. Яшечкин, Н.В. Хуторецкая, В.Ф. Ларичев, К.А. Саркисян, М.С. Воробье-

ва, А.М. Бутенко, А.Н. Куличенко, Д.К. Львов, В.В. Кутырев // Проблемы особо

опасных инфекций. – 2006. – № 2(92). – С. 54-58.

13.В.Ф. Ларичев ИФА- и ПЦР-тест-системы, предназначенные для детекции виру-

са Крыской-Конго геморрагической лихорадки / И.Н. Манзенюк, Е.В. Найдено-

ва, Л.С. Карань, И.Н. Щербакова, Н.В. Хуторецкая, М.А. Скороход, А.Н. Кули-

ченко, М.С. Воробьева, А.Е. Платонов, А.М. Бутенко // Вопросы вирусологии. –

2007. – №4. – С. 43-46.

14.Красовская Т.Ю. Разработка и внедрение тест-системы для лабораторной диа-

гностики лихорадки Западного Нила методом ПЦР / И.Н. Шарова, С.А. Щерба-

кова, Ю.И. Яшечкин, Н.В. Хуторецкая, В.Ф. Ларичев, A.M. Бутенко, А.Н. Кули-

ченко // Здоровье населения и среда обитания. – 2007. – № 6. – С. 42-45.

15.Писарев В.Б. Структурные изменения в продолговатом мозгу и легких мышей

при подкожном введении возбудителя лихорадки Западного Нила / А.М. Бутен-

46

ко, А.В. Смирнов, Н.В. Григорьева, Н.В. Хуторецкая, В.Ф. Ларичев, М.В.

Шмидт, В.А. Глухов, Л.С. Быхалов, Л.Н. Кириченко // Морфология. – 2008. –

Т.133. – № 2. – С. 107a.

16.Глухов В.А. Структурные изменения в нейронах гипоталамуса при эксперимен-

тальном воспроизведении лихорадки Западного Нила / А.В.Смирнов, М.В.

Шмидт, А.М. Бутенко, Н.В. Хуторецкая, В.Ф. Ларичев // Вестник Волгоградско-

го государственного медицинского университета. – 2009. – № 2. – С.74-76.

17.Клименко И.С. Результаты обследования здоровых жителей южного региона

России и лихорадящих больных на антитела к вирусам москитных лихорадок /

А.М. Бутенко, В.Ф. Ларичев, С.А. Терехин, А.С. Азарян, Т.Е.Аршба // Меди-

цинская паразитология и паразитарные болезни. – 2009. – №4. – С.11 – 14.

18.Смирнов А.В. Морфологическая характеристика сосудов миокарда левого желу-

дочка мыши в норме и при вирусной инфекции / Бутенко A.M., М.В. Шмидт,

В.Ф. Ларичев, Н.В. Хуторецкая, И.М. Чеканин, В.А. Толокольников, П.Н. Гон-

чаров, В.А. Глухов // Морфология. – 2009. – Т.136. – №4. – С.127-128.

19.Помелова В. Г. Иммуночип на основе микропланшетной технологии ФОСФАН

для определения IgG-антител к вирусам Западного Нила и Крымской-Конго ге-

моррагической лихорадки / Т.А. Быченкова, Ларичева С.Ю., Н. С. Осин, А. М.

Бутенко, В. Ф. Ларичев, Н. В. Хуторецкая // Вопросы вирусологии. – 2010. –

№2. – С.14-17.

20.Ларичев В. Ф. Случай крымской-Конго геморрагической лихорадки в Анапском

районе Краснодарского края / О.М. Пиликова, Ю.В. Юничева, Г.В. Гальцева,

Т.Е. Рябова, Л.Е. Василенко, А.М. Бутенко // Вопросы вирусологии. – 2010. –

№4. – С. 39-41.

21.Путилина Н.Г. Применение ОТ-ПЦР и иммуноферментного анализа для специ-

фической диагностики крымской геморрагической лихорадки / А.Р. Азарян, И.Н.

Трусова, П.М. Мальков, А.П. Гришанова, А.И. Ковтунов, Г.Л. Шендо, А.Ф.

Джаркенов, Т.Е. Аршба, В.Ф. Ларичев, А.М. Бутенко // Вопросы вирусологии –

2011. – №4. – С. 34–38.

22.Ларичев В.Ф. Завозные случаи арбовирусных инфекций в Российской Федера-

ции / М.А. Сайфуллин, Ю.А. Акиншина, Н.В. Хуторецкая, А.М. Бутенко // Эпи-

демиология и инфекционные болезни. – 2012. – №1. – С. 35-38.

23.Сайфуллин М.А. Случай тяжелой лихорадки денге на фоне болезни Вильсона-

Коновалова / В.А. Кадышев, В.Ф. Ларичев, О.И. Андрейцева, П.В. Бойцов, А.М.

47

Бутенко, Н.А. Малышев // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2012. –

№5. – С.50-53.

24.Сайфуллин М.А. Завозные случаи лихорадки денге в Москве в 2009-2011 гг.:

особенности клиники и лабораторных показателей / В.Ф. Ларичев, Ю.А. Акин-

шина, Н.В. Хуторецкая, А.М. Бутенко, Н.А. Малышев // Эпидемиология и ин-

фекционные болезни. – 2012. – № 6. – С. 29-35.

25.Трусова И.Н. Динамика специфических IgM и IgG антител у больных Крымской

геморрагической лихорадкой / А.М. Бутенко, В.Ф. Ларичев, М.Ю. Щелканов,

А.Р. Азарян, А.П. Гришанова, Е.И. Иващенко, Т.Е. Аршба, М.В. Говорухина,

Н.Ю. Асмолова, И.О. Сиденко, Н.Ф. Василенко, Н.В. Русакова, Л.В. Шишкина,

Б.Ц. Бушкиева // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2013. – № 2. – С.

17-24.

26.Бутенко А.М. Лихорадка Западного Нила в Тульской области / Козлова А.А.,

Ларичев В.Ф., Дзагурова Т.К., Пантюхова Р.А., Важненкова Н.С., Карлова В.М.,

Василькова О.И. // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2014. – №2. –

С.20-25.

27.Азарян

А.Р.

Опыт

применения

ИФА

тест-систем

для

серологической

диагностики лихорадки Западного Нила / А.П. Гришанова, Е.И. Иващенко, Г.Л.

Шендо, А.И. Ковтунов, С.Ж. Неталиева, М.А. Бабаева, А.В. Буркин, Т.Е. Аршба,

В.Ф. Ларичев, А.М. Бутенко // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2014.

– №2. – С.59-62.

28.Ларичев В.Ф. Иммуноферментные тест-системы для диагностики эндемичных

для России и завозных тропических арбовирусных инфекций / В.Ф. Ларичев,

А.А. Козлова, М.А. Сайфуллин, Н.В. Хуторецкая, В.М. Шкинев, А.М. Бутенко //

Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2015. – №6. – С. 44-46.

29.Lvov D.K. Isolation оf two strains оf West Nile Virus during аn outbreak in Southern

Russia, 1999 / A.M. Butenko, V.L. Gromashevsky, V.Ph. Larichev, S.Ya.

Gaidamovich, O.I. Vyshemirsky, A.N. Zhukov, V.V. Lazorenko, V.N. Salko, A.I.

Kovtunov, K.M. Galimzyanov, A.E. Platonov, T.N. Morozova, N.V. Khutoretskaya,

E.O. Shishkina, T.M. Skvortsova // Emerging Infectious Diseases. – 2000. – Т. 6. –

№ 4. – Р. 373-376.

30.Papa A. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Greece / A. Papa, P. Sidira, V.

Larichev, Gavrilova L., Kuzmina K., Mousavi-Jazi M., Mirazimi A., Ströher U., S.

Nichol // Emerging Infectious Diseases. – 2014. – V.20. – №2. – Р.288-290.

48

Благодарности

Хочу выразить свою искреннюю благодарность моему научному консультан-

ту Лауреату Государственной премии, профессору Александру Михайловичу Бу-

тенко, чей колоссальный опыт, знания и интеллектуальная стимуляция оказались

решающими при выполнении и написании данной работы.

Неоценимую помощь в проведении исследований оказали сотрудники лабо-

ратории биологии и индикации арбовирусов: к.б.н. Н.В. Хуторецкая, А.А. Козлова,

к.б.н. Н.В. Кузнецова,

д.х.н. В.М. Шкинев,

М.А. Скороход,

Н.В. Титова,

А.Н. Сдобникова, Г.И. Старых, Г.И. Пешкова, И.В. Дайлак.

Выражаю глубокую благодарность всем сотрудникам НИИ вирусологии им.

Д.И. Ивановского, за то участие и внимание, с которым относились к моим вопро-

сам. Особенно хотелось бы выделить д.б.н. М.Ю. Щелканова, д.б.н. О.В. Масалову,

к.б.н. А.Г. Прилипова за оказанную консультативно-методическую помощь. Так же

хочу поблагодарить рецензентов: д.б.н., профессора О.А. Верховского, к.б.н.

Е.И. Исаеву и д.б.н. Ю.Н. Хомякова.

Выполнение данной работы было бы невозможным без взаимодействия с ру-

ководителями, врачами и специалистами учреждений здравоохранения и Роспо-

требнадзора Астрахани, Волгограда, Москвы, Новороссийска, Ростова-на-Дону,

Ставрополя,

Сочи,

Саратова:

А.И. Ковтуновым,

Х.М. Галимзяновым,

А.Ф. Джаркеновым, А.Р. Азарян, А.П. Гришановой, Г.Л. Шендо, Т.Е. Аршбой,

С.Ж. Неталиевой, Е.И. Иващенко, Н.Г. Путилиной (Астрахань), А.Н. Жуковым,

Н.В. Русаковой, Л.В. Шишкиной, Н.М. Чемидовой (Волгоград), Н.А. Малышевым,

Ф.В. Румо,

М.А. Сайфуллиным

(Москва),

О.М. Пиликовой,

В.И. Малаем,

С.К. Дерлятко (Новороссийск), Г.В. Айдиновым, М.В. Говорухиной, Т.В. Мазрухо

(Ростов-на-Дону),

И.Н. Шаровой,

Е.В. Найденовой,

Т.Ю. Красовской,

С.А Щербаковой (Саратов), Ю.В. Юничевой, Т.Е. Рябовой, Л.Е. Василенко (Сочи),

А.Н. Куличенко, Н.Ф. Василенко (Ставрополь).

Считаю своим долгом выразить свою благодарность и признательность руко-

водству НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского за создание условий и содействие

в проведении работы.



 
Похожие работы:

«УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ УДК: 616.24-036.12-052-06:616.155.32 КАДУШКИН Алексей Геннадьевич ОСОБЕННОСТИ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ В ПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ И ИХ ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ РОЛЬ У КУРЯЩИХ И НЕКУРЯЩИХ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.01.04 – биохимия Минск 2015 Научная работа выполнена в учреждении образования...»

«УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ВИТЕБСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ УДК 618.145:616-007.61-07-084 ЛЫСЕНКО Ольга Викторовна ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ЭНДОМЕТРИЯ: КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА, ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.01.01 – акушерство и гинекология Витебск, 2015 Официальные оппоненты: Оппонирующая организация: Воскресенский Сергей Львович, доктор медицинских наук, профессор,...»

«Одинец Алексей Глебович НОВЫЕ ПОДХОДЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ПРОДУКТОВ ДЛЯ ДИЕТИЧЕСКОГО ПИТАНИЯ ИЗ БУРЫХ МОРСКИХ ВОДОРОСЛЕЙ 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2015 1 Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук Доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор главный научный сотрудник кафедры гидробиологии...»





 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.