авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

На правах рукописи

ЖУЧЕНКО МАКСИМ АНДРЕЕВИЧ

РАЗРАБОТКА КОМПОЗИЦИОННОГО СОСТАВА

И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ЭТАПОВ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ

МОДЕЛЬНЫХ ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ Е7-БТШ70

03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2016

1

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии

«Государственный

научно-исследовательский

институт

генетики

и

селекции

промышленных микроорганизмов («ФГУП ГосНИИгенетика»)

Научный руководитель:

ХАМИТОВ РАВИЛЬ АВГАТОВИЧ, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

ТИХОНОВ ИГОРЬ ВЛАДИМИРОВИЧ, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ

ВПО «Московская

государственная

академия

ветеринарной

медицины

и

биотехнологии имени К.И. Скрябина», кафедра биотехнологии, руководитель.

ГУСАРОВ ДМИТРИЙ АЛЕКСЕЕВИЧ, кандидат химических наук, ГУ НИИ «Научно-

исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи»,

научный сотрудник, руководитель экспериментального производства.

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических

технологий им. М.В. Ломоносова».

Защита состоится «______» _______________ 2016 г. в ______ часов на

заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский

и

технологический

институт

биологической

промышленности

Россельхозакадемии» по адресу: 141142, Россия, Московская обл., Щёлковский р-

н, п. Биокомбината, д. 17; тел.: 8 (496) 567-32-63; еmail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ ВНИТИБП (141142,

Россия, Московская обл., Щёлковский р-н, п. Биокомбината, 17) и на сайте

http://mgavm.ru.

Автореферат разослан «______» _______________ 2016 г. и вывешен на сайте

http://mgavm.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук

2

ФРОЛОВ ЮРИЙ ДМИТРИЕВИЧ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВПЧ – вирус папилломы человека;

Е7 – онкопротеин №7 вируса папилломы;

L1 – капсидный протеин №1 вируса папилломы;

БТШ70 – белок теплового шока 70 кДа;

ICH - The International Conference on Harmonisation of Technical

Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use

(Международная конференция

по

гармонизации

технических требований для

регистрации фармацевтических препаратов, используемых человеком);

ICH Q8 – Pharmaceutical Development (Фармацевтическая разработка);

CTD – Common Technical Document (Общий технический документ);

АФИ – активная фармацевтическая субстанция;

ГЛФ – готовая лекарственная форма;

ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота;

PMSF – фенилметилсульфонилфторид;

АТФ – аденозинтрифосфат;

SDS – лаурилсульфат натрия;

DTT – дитиотреитол;

GSH – L-глутатион;

IMAC - иммобилизованная ионом металла аффинная хроматография;

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография;

MS MALDI TOF - времяпролётная масс-спектроскопия в режиме матрично-

активированной лазерной десорбции и ионизации;

ЭФ в ПААГ – электрофорез в полиакриламидном геле;

CD14/F4/80 - общий маркер экспрессии моноцитов, прошедших окончательную

дифференцировку;

CD8 - общий маркер экспрессии цитотоксических Т-лифоцитов;

CD3/NK1.1 - общий маркер экспрессии активированных NK-клеток;

CD4/IFNγ - общий маркер экспрессии субпопуляции T-хелперов первого типа;

USP, EP, JP, BP – Американская, Европейская, Японская, Британская

Фармакопеи;

ПЭТФ - полиэтилентерефталат-гликоль;

FDA, IID - Food and Drug Administration, Inactive Ingredient Database

(Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и

медикаментов, База данных вспомогательных веществ);

CSM - Committee on Safety of Medicines (Комитет по безопасности

лекарственных средств Великобритании);

NNHPD - Natural and Non-prescription Health Products Directorate

(Управление по натуральным и безрецептурным препаратам Канады)

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Группа вирусов папилломы включает свыше

100 различных типов; как минимум 13 из них приводят к развитию некоторых форм

рака у человека, в частности, рака шейки матки, рака влагалища, полового

члена. Установлено, что вирусы папилломы 16 и 18 типов в 70% случаев служат

основным провоцирующим фактором в развитии рака шейки матки и предраковых

патологий

шейки

матки. Домашние

животные

также

склонны

к

инфицированию

папилломавирусом. Папилломы

наиболее

сильно

распространены

среди

крупного

рогатого скота, лошадей, кошек и собак.

На

сегодняшний

день

терапия

заболеваний, ассоциированных

с

ВПЧ,

осуществляется

двумя

зарегистрированными

в

РФ

вакцинами

Гардасил® и

Церварикс®, содержащих

в

качестве

действующих

веществ

рекомбинантные

вирусоподобные частицы главного капсидного белка ВПЧ L1. Препараты направлены

на

профилактику

инфекций, вызываемых

ВПЧ 6, 11, 16 и 18 типов, и

ассоциированных

с

ними

заболеваний, таких

как

рак

половых

органов,

генитальных бородавок и неоплазий.

Существенным недостатком имеющихся вакцин является их профилактическая

направленность, низкая

эффективность

при

вакцинации

пациентов

среднего

и

пожилого

возраста, необходимость

повторной

вакцинации, высокая

стоимость.

Отечественных

профилактических

и

терапевтических

вакцин

для

лечения

заболевших

не

разработано, что

в

контексте

программы

импортозамещения

обосновывает актуальность темы исследования.

Качество

фармацевтического

продукта

не

может

быть

доказано

за

счёт

выходного

контроля, а

должно

закладываться

на

этапе

фармацевтической

разработки. Фармразработка, впервые

описанная

в ICH Q8, нацелена

на

моделирование

качественного

продукта, обеспеченного

надлежащим

процессом

производства, а

также

позволяет

выработать

научно-обоснованный

подход

к

разработке спецификаций и управлению рисками качества. Основные понятия и

этапы

фармацевтической

разработки

биофармацевтических

препаратов,

адаптированные под описываемое исследование, предложены на рисунке 1.

Последние

изменения

отечественного

законодательства - ФЗ

№429 от

22.12.2014 гармонизируют требования, предъявляемые к производству и контролю

лекарственных

препаратов

для

медицинского

и

ветеринарного

применений, и

дополняет ФЗ №61. В этом свете, а также вследствие поэтапного перехода на

регистрационный

формат CTD, правильное

планирование

фармацевтической

разработки

является

приоритетной

задачей. Настоящее

исследование

является

частью масштабной НИИР, проведённой в рамках государственных контрактов №

16.N08.12.1024 и № 13411.1008799.13.173, и направлено на реализацию этапов

дизайна

молекулы

и

дизайна

лекарственной

формы (рис. 1). Результаты

исследований могут быть применимы в фармацевтике и ветеринарии.

4

Дизайн молекулы

(Molecule design)

Дизайн лекарства

(Drug design)

Дизайн качества

(Quality by design)

Рисунок 1. Этапы фармацевтической разработки. Цветом выделена область фармаразработки описываемого

исследования.

СТЕПЕНЬ РАЗРАБОТАННОСТИ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Предложенное

решение

основано

на

использовании

гибридных

белков,

состоящих из аминокислотных последовательностей онкобелка Е7 вируса папилломы

человека 16 и 18 типов, конъюгированных с аминокислотной последовательностью

белка теплового шока 70 кДа Mycobacterium tuberculosis (рис. 2). Известно,

что

онкобелок E7 участвует

в

пролиферации

опухолевых

клеток

при

ВПЧ

инфекциях, что делает его подходящей мишенью для использования в качестве

действующего

вещества

лекарственных

препаратов. БТШ70, в

свою

очередь,

участвует в активации клеточного иммунитета и способен усиливать иммунный

ответ за счёт участия в процессе презентации антигена. Предполагается, что

распознавание онкобелка Е7 иммунокомпетентными клетками более избирательно и

специфично чем в отношении капсидного L1; дополнительная конъюгация Е7 с

БТШ70 способна повысить иммуногенность единого антигена.

В

научной

литературе

имеется

ряд

информаций

о

способах

получения

и

изучении

иммуногенности

гибридных

белков

Е7-БТШ70, однако, наряду

с

проблемами низкой продуктивности и

пирогенности при

культивировании

в E.

Coli, авторы не приводят подробной информации по способам очистки целевых

белков и не освещают особенности их последующей стабилизации в растворе.

Стабильные

фармацевтические

субстанции

и

готовые

формы

с

действующими

веществами Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70 на сегодняшний день не разработаны. По

этой причине выделение гибридных белков, а также получение АФИ и ГЛФ на их

основе, являются актуальным задачами.

5

► биоинформатика, генетика, создание конструкции

► выбор организма-продуцента, культивирование

► выделение, очистка,

► первичная характеризация

► обоснование состава, выбор формы,

► определение критических параметров качества

► вспомогательные вещества, исследование стабильности

► разработка технологии производства

► проведение доклинических исследований

► разработка нормативной и технологической документации

► масштабирование технологии

► проведение клинических исследований

► разработка спецификации

► разработка методов контроля качества

► валидация аналитических методов

► перенос методов контроля качества

ЦЕЛИ

И

ЗАДАЧИ

ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью

исследования

является

разработка

безопасной

технологических

биотехнологической

этапов

производства

качественной

и

вакцины. Гибридные

белки

Е7-БТШ70 предложены

как

перспективная

модель

для

создания

эффективной

вакцины. Методы

очистки,

обеспечивающие

выделение

чистого

препарата, обладающего

антигенными

и

иммуногенными

свойствами, должны

способствовать

получению

нетоксичного,

апирогенного материала, свободного от клеточного балласта. Схема достижения

поставленной цели построена в соответствии с требованиями ICH Q8 (рис. 1).

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- Разработать

технологическую

схему

хроматографической

очистки

целевых

рекомбинантных белков Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70;

- Произвести оценку антигенных и иммуногенных свойств гибридных белков;

- Предложить компонентные составы субстанций Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70,

Рисунок 2. Иммунодоминантные регионы Е7 16 типа и БТШ70. Жёлтый – последовательность Е7 и БТШ, синий –

линкерные участки, зелёный – эпитопы Е7 и БТШ70, красный – вариабельный участок БТШ70, не кодируемый

генами Е7-БТШ70.

обеспечивающие

месяцев,

стабильность

при

хранении, как

минимум, на

протяжении 6

- Подобрать эффективный адъювант и предложить состав вакцины Е7-БТШ70,

обеспечивающий

сохранение

активности

и

стабильности

при

хранении, как

минимум, на протяжении 18 месяцев,

- Отработать технологическую схему производства вакцины в рамках опытно-

промышленного производства;

- Рассчитать

экономическую

эффективность

разработанной

технологии

производства вакцины;

6

- Оценить безопасность вакцины в рамках доклинических исследований.

НАУЧНАЯ

НОВИЗНА. Выделены

и

идентифицированы

балластные

белки,

препятствующие

тонкой

очистке

гибридных

белков, разработана

универсальная

трёхстадийная

схема

хроматографической

очистки, обеспечивающая

получение

гибридных

белков

с

чистотой

не

менее 95%. Подобран

компонентный

состав

субстанций, обеспечивающий

сохранность

физико-химических

и

биологических

свойств

гибридных

белков

на

протяжении 12 месяцев, разработана

технологическая

схема

очистки

субстанций. Исследована

иммуногенность

различных комбинаций гибридных белков и адъювантов, выбрана доза и адъювант,

обеспечивающие активность и стабильность вакцины при хранении на протяжении

18 месяцев. Разработаны

технологическая

схема

хроматографической

очистки

субстанций и технологическая схема производства вакцины.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Данные, полученные в

ходе диссертационной работы, позволили получить и охарактеризовать модельные

гибридные

белки

Е7-БТШ70, предназначенные

для

использования

в

качестве

действующих

веществ

вакцины

против

заболеваний, ассоциированных

с

ВПЧ.

Разработанная

методика

очистки

может

быть

применима

к

ряду

антигенов

на

основе структурных элементов разнообразных семейств ДНК-содержащих вирусов,

помимо онкопротеинов Е7, включающих Т-антиген полиомавируса SV-40 и фактор

синтеза Е1а аденовируса, а также их конъюгированные производные. Показана

стабильность

субстанций

и

вакцины, разработаны

техническая

и

нормативная

документация

для

их

производства: технологические

карты, методики,

фармацевтическая

статья

предприятия, описывающие

процесс

производства

и

спецификацию

вакцины.

на продукт. Проведены доклинические испытания терапевтической

ЛИЧНЫЙ

ВКЛАД

СОИСКАТЕЛЯ. Автор

выполнял

разработку

и

оптимизацию

процессов

металл-хелат-аффинной, анионообменной

и

гель-фильтрационной

хроматографий. Автором проведена идентификация примесного профиля, скриннинг

композиционного

состава

субстанций

и

вакцины, исследована

стабильность

препаратов

при

хранении

и

наработаны

опытные

серии

для

обеспечения

доклинических исследований препарата. Методы контроля качества субстанций и

вакцины разрабатывалась совместно с сотрудниками аналитической лаборатории и

с Кухаренко А.Е. (ФГУП ГосНИИгенетика).

СТЕПЕНЬ

ДОСТОВЕРНОСТИ

И

АПРОБАЦИЯ

РЕЗУЛЬТАТОВ

ДИССЕРТАЦИИ. Проверка

текста

диссертационной

работы, осуществлённая

интерактивной

программой

АНТИПЛАГИАТ (https://www.antiplagiat.ru/), установила, что

диссертация

является оригинальной на 97,19% при заимствовании, оцененном равным 2,81%.

Заимствованные источники в подавляющем количестве относятся к разделу «Обзор

литературы». Основные

результаты

исследований

доложены

на

межлабораторном

семинаре

сотрудников

Государственного

научно-исследовательского

института

7

биохимические свойства гибридных белков во многом совпадают со

онкобелков Е7 и белков теплового шока.

2. Разработана

технология

хроматографической

очистки,

свойствами

включающая

металл-хелат-аффинную хроматографию в денатурирующих

условиях, позволяющую

получить целевой белок со степенью чистоты 85%, два этапа анионообменной

хроматографии, увеличивающую

чистоту

материала

более

чем 95% и

гель-

фильтрационную хроматографию, предназначенную для перевода гибридных белков в

буфер активной фармацевтической субстанции.

3. Выбрана комбинация сахарозы, полисорбата 80 и фосфатного буферного

раствора в диапазоне рН 6.8 – 7.4, позволяющая получить стабильные растворы

субстанций

гибридных

белков, сохраняющие

показатели

качества

в

пределах

спецификации в течение 12 месяцев при хранении при -20 оС.

4. Показано, что сорбция гибридных белков на гидроокись алюминия и их

последующее однократное введение мышам С57BL/6 вызывает наибольшую экспрессию

рецепторов

клеток, специфичных

при

иммунном

ответе

на

ВПЧ, включая

Т-

хелперные, Т-цитотоксические

и NK-клетки, обуславливая

значительный

фармакодинамический эффект при введении вакцины и её стабильность в течение

18 месяцев при хранении при 2-8 оС.

МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Описанные

исследования

проводились

в 2012 – 2014 гг. в

отделе

медицинской

биотехнологии

ФГУП «ГосНИИгенетика». Штаммы-продуценты

Saccharomyces Cerevisiae SCR-702-E7(16)-HSP70 и SCR-702-E7(18)-HSP70

разработаны

лабораторией

эукариотических

систем

экспрессии

генов

ФГУП

«ГосНИИгенетика» под руководством Козлова Д.Г. и депонированы во ВКПМ.

8

генетики и селекции промышленных микроорганизмов и совещании сотрудников ООО

«ФАРМАПАРК» (Москва, 2015).

ПУБЛИКАЦИИ. По результатам диссертации опубликовано 5 статей в научных

журналах, рекомендованных ВАК.

СТРУКТУРА

И

ОБЪЕМ

ДИССЕРТАЦИИ. Работа

состоит

из

введения, обзора

литературы, описания

собственных

исследований, материалов

и

методов

исследований, результатов исследований, обсуждения

полученных результатов,

выводов, описание практического использования результатов, рекомендаций по

использованию научных выводов, списка литературы и приложений. Диссертация

изложена на 142 страницах, включая 24 рисунка и 22 таблиц. Список цитируемой

литературы содержит 130 источников.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ И РЕЗУЛЬТАТЫ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Идентифицирован

профиль

примесных

белков

в

субстанциях

целевых

белков Е7-БТШ70 и выбраны условия получения активных субстанций на их основе

с содержанием основного вещества не менее 95%. Показаны антигенные свойства

гибридных белков в отношении первичных антител к Е7 и БТШ70. Установлено, что

Культивирование штаммов-продуцентов проводили в ферментере Biostat C30

(BBI, Германия). В ходе культивирования в среду вносили подпитки – сахарозу,

глюкозу, глицерин, дрожжевой экстракт, казаминовые кислоты, фосфаты. Биомассу

диспергировали в лизирующем буфере, содержащем Tрис-HCl, имидазол, NaCl,

мочевину, полисорбат 20, ЭДТА, дитиотреитол, PMSF, pH 8.0. Суспензию клеток

разрушали в дезинтеграторе APV 1000 (APV, Дания).

Первичную наработку целевых белков проводили методом металл-хелат-

аффинной хроматографии на сорбенте IMAC 6 FF (GE, США) и аффинной

хроматографии на АТФ-сефарозе 4B с использованием системы АКТА Purifier (GE,

США) под управлением программного обеспечения Unicorn 4.0. Определение

примесного профиля осуществляли методом времяпролётной масс-спектроскопии в

режиме матрично-активированной лазерной десорбции и ионизации на оборудовании

Ultrafle Xtreme (Bruker, Германия), в качестве исходного материала

использовали фрагменты полиакриламидного геля со стадии электрофоретического

разделения по стандартной методике Лэммли в невосстанавливающих условиях.

Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot.

Ионообменную хроматографию с последующим концентрированием проводили на

анионообменном

сорбенте Q HP Sepharose (GE, США). Изоэлектрическое

фокусирование в геле проводили с использованием системы Multiphor II (GE,

США), в качестве

красителя использовали Кумасси R-250. Финальный перевод

белков в буфер АФИ осуществляли при помощи гель-фильтрационной хроматографии

с использованием сорбента Superdex 200 (GЕ, США). Анализ чистоты проводили по

стандартной методике Лэммли в невосстанавливающих условиях в 8 % ПААГ с

последующим

окрашиванием

Кумасси R250 или

нитратом

серебра, установление

подлинности – методом

иммуноблоттинга

с

инкубацией

мембран

первичными

антителами к Е7 и БТШ70 (HyTest, Финляндия).

Скрининг

композиционного

состава

активных

фармацевтических

субстанций

проводили в несколько этапов с использованием метода «ускоренного хранения»,

выдерживая тестируемые образцы при +5 оС, +25 оС и +37 оС в течение 60 и 80

дней

в

зависимости

от

этапа

скрининга. Оценку

чистоты

гибридных

белков

проводили по методике Лэммли в невосстанавливающих условиях в 8 % ПААГ с

последующим

окрашиванием

нитратом

серебра, концентрацию

определяли

колориметрическим методом с бицинхониновой кислотой.

Первичную оценку специфической иммунологической активности

экспериментальных вакцин проводили путём иммунизации мышей С57BL/6 с

последующим забором селезенки на 1, 14 и 21 сутки после однократного введения

тестируемых вакцин. Иммунофенотипирование клеток селезёнки осуществляли

методом проточной цитофлюориметрии на цитофлюориметре Facs Cantu II (BD,

США), контролируя экспрессию клеточных маркёров CD14/F4/80, CD8, CD3/NK1.1 и

CD4/IFNγ, для контроля экспрессии использовали коммерческие антитела (BD,

9

США). Интерферон гамма определяли, используя коммерческий набор CBA Mouse

Cytokine Kit (BD, США). Обработку результатов осуществляли при помощи

программы FacsDiva 4.1. Статистическую обработку полученных результатов

проводили с помощью программы Excel.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первичная

наработка

материала

для

выбора

методики «захвата» целевого

материала и изучения примесного профиля

Качество и эффективность вакцины закладываются на этапах выделения и

очистки

целевых

белков. На

начальном

этапе

разработки

технологии

хроматографической очистки гибридных белков Е7-БТШ70 использовали аффинную

хроматографию. В

качестве

металл-хелат-аффинных

сорбентов, обладающих

сродством к полигистидиновому региону Е7-БТШ70, использовали IMAC Sepharose 6

FF и IMAC Sepharose 6 HP. Аффинная колонна, активированная АТФ, была выбрана

для специфического взаимодействия с АТФ-связывающими регионами аминокислотных

последовательностей онкобелка Е7 и белка теплового шока.

← Рисунок 3. Оценка чистоты целевых фракций после очистки на

сорбентах IMAC Sepharose HP и IMAC Sepharose FF. А – лизат на HP,

Б – нулевой объём НР, В – элюат после НР, Г – лизат на FF, Д –

нулевой объём FF, Е – элюат после FF.

Чистота

целевых

фракций

после

очистки

с

использованием аффинных сорбентов не превышала

70%,

демонстрируя

наличие

как

низкомолекулярных, так

и

высокомолекулярных

примесей. Было

определено, что

при

приблизительно одинаковом количестве олигомеров

в целевых фракциях, IMAC Sepharose FF обладает большей эффективностью при

удалении низкомолекулярных примесей, что является приоритетным для получения

биопрепаратов высокого качества (рис. 3). Вместе с тем, при оценке ёмкости

сорбентов наблюдалось незначительное превосходство IMAC Sepharose HP над IMAC

Sepharose FF. Ёмкость

и

эффективность

очистки

на

активированной

АТФ

сефарозной

колонне

значительно

уступали

металл-хелатным

аналогам. Таким

образом, для проведения первой стадии очистки рекомбинантных белков Е7-БТШ70

была показана целесообразность использования сорбента IMAC Sepharose FF.

Для оптимизации хроматографической

очистки

и

последующей стабилизации

гибридных белков в растворе была проведена идентификация примесного профиля

методом MS MALDI TOF. Показано, что низкомолекулярные примеси представлены

продуктами деградации целевого белка и фрагментами белков штамма-продуцента

Saccharomyces cerevisiae, такими

как, фактор

элонгации

трансляции TEF1a,

рибосомальные протеины L26bp и 33b и гликогенные ферменты дрожжей UGP1p,

UTP1p. Высокомолекулярные примеси – это продукты олигомеризации Е7-БТШ70.

10

Наличие

примесных

пептидов

может

быть

обусловлено

шаперонной

активностью

онкопротеина Е7 и белка теплового шока 70.

Очистка

с

применением

гель-фильтрационной

ВЭЖХ

с

предварительной

обработкой

материала

нанесения

восстанавливающими

агентами

показала, что

профиль элюции зависит от типа используемых агентов, среди которых комбинация

0,3% (м/м) SDS и 40 мМ DTT обеспечивает переход белка в мономерное, не

связанное с примесными белками, состояние. Степень чистоты мономера составила

97,5% (ЭФ а ПААГ), аминокислотная последовательность с высокой достоверностью

соответствовала заявленной (рисунки 4, 5). Специфичность и чувствительность

антител

к

онкобелку E7 и

БТШ70 были

доказаны

методом

иммуноблоттинга

с

использованием антител к Е7 и БТШ70.

Рисунок 4

Масс-спектрограмма триптического

гидролизата белка Е7(16)-БТШ70.

Рисунок 5

Профиль

электрофоретического

разделения элюата мономера Е7(16)-БТШ70. Б –

образец

до

разделения, Д – образец

после

разделения

Результаты хроматографической очистки, полученные при использовании SDS и

DTT, показали повышенную склонность Е7-БТШ70 к олигомеризации и образованию

межмолекулярных

взаимодействий

с

низкомолекулярными

белками. На

этом

основании, при дальнейшей оптимизации очистки гибридных белков было решено

тестировать влияние диссоциирующих и хаотропных агентов.

Исследование влияния денатурирующих агентов на процесс металл-хелат-аффинной

хроматографии.

В качестве исходных условий хроматографического разделения на сорбенте

IMAC Sepharose FF использовали параметры, полученные при наработке материала

для

изучения

примесного

профиля. Отфильтрованный

лизат, полученный

при

дезинтеграции 100 г биомассы, наносили на колонну, промывали 2 л буферного

раствора VHP IMAC A1: 20 мМ Трис HCl, 30 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 0,1%

полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, pH=8,0. Элюцию осуществляли градиентом от 0 до 60 %

из буфера VHP IMAC A1 в буфер VHP IMAC B1: 20 мМ Трис HCl, 500 мМ имидазол,

500 мМ NaCl, 0,1% полисорбат 20, 1 мМ

ЭДТА, pH=8,0. Приведённая

схема

11

серии

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Концентрация тестируемого агента

Соотношение форм Е7-БТШ70, %

GSH, мМ DTT, мМ

Цистин, Мочевина,

мМ

М

Олигомеры

Мономеры

Примеси

-

-

10

30

10

30

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

10

-

30

-

10

-

30

-

-

10

-

30

-

10

-

30

-

20

68

12

4

18

71

11

-

10

80

10

-

10

81

9

4

11

79

10

4

11

80

9

-

11

77

11

-

12

79

9

4

12

77

11

4

11

78

11

-

15

75

10

-

17

73

10

4

15

74

11

4

15

75

10

позволяет получить 1270 мг и 1490 мг белков 16 и 18 типов, соответственно,

однако, основным

недостатком

схемы

является

низкая

чистота

целевого

материала.

Для понижения количества продуктов олигомеризации Е7-БТШ70 использовали

диссоциирующие и хаотропные агенты. Известно, что агрегация может протекать

посредством образования дисульфидных «мостиков» и гидрофобных взаимодействий

между

молекулами. Для

удаления

дисульфидных «мостиков» тестировали

восстанавливающие

агенты: восстановленный L-глутатион (GSH), дитиотреитол

(DTT) и

цистин; для

устранения

нежелательных

гидрофобных

взаимодействий

применяли мочевину.

Таблица 1.

Зависимость соотношения олигомерных, мономерных форм и низкомолекулярных примесей Е7(16)-БТШ70 после

введения восстанавливающих и хаотропных агентов на стадии металл-хелат-аффинной хроматографии

Соотношения моно-, ди- и олигомерных форм целевого белка, полученные для

обработанных детергентами клеточных лизатов, приведены в таблице 1. Видно,

что внесение GSH и DTT в минимальной концентрации 10 мМ, а также комбинации

этих

агентов

с

мочевиной

позволяет

практически

в

два

раза

сократить

содержание олигомеров в лизате. Для оценки чистоты целевого белка и его

выхода на стадии были проведены два сравнительных процесса очистки. Буферные

растворы VHP IMAC A3, В3 содержали 4 М мочевину и 10 мМ GSH, растворы VHP

IMAC A4, В4 содержали 10 мМ GSH. Анализ целевых фракций показал, что буферный

раствор VHP IMAC A4, В4 является приоритетным, приводя к незначительному

снижению выхода белка по сравнению со стандартным процессом.

Для снижения гидрофобных взаимодействий между целевым белком и примесями

были изучены два направления. Первое заключалось в увеличении концентрации

полисорбата 20 в буферных растворах (VHP IMAC A5, В5) и материале нанесения

до 2%. Второй подход предусматривал введение в буферные растворы (VHP IMAC

A6, В6) и материал нанесения глицерина в концентрации 10%. Оценка чистоты

полученных

фракций (рис. 3, 6) продемонстрировала, что

увеличение

концентрации полисорбата не влияет на чистоту целевого белка, одновременно с

12

Рисунок 6.

Сравнительная

оценка

чистоты

элюатов

Е7(16)-БТШ70 при окрашивании геля нитратом

серебра (Б, В, Г) и кумасси (Д, Е, Ж). Б, Ж

– элюат после очистки на IMAC Sepharose FF

(буферные растворы IMAC А6, В6), В, Е –

элюат

после

первичной

очистки

на Q HP

Sepharose (буферные растворы VHP Q A2, B2),

Г, Д – элюат после доочистки на Q HP

Sepharose (буферные растворы VHP Q A7, B7).

Оптимизация компонентного состава буферных растворов на стадии «захвата»

белка

металл-хелат-аффинной

хроматографией

позволила

увеличить

чистоту

целевых форм Е7-БТШ70 на 15% по сравнению с результатами, полученными при

использовании

исходных

буферных

растворов. Финальный

состав

буферных

растворов VHP IMAC: VHP IMAC A1 - 20 мМ Трис HCl, 30 мМ имидазола, 500 мМ

NaCl, 0,1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ GSH, 10% глицерин, pH=8,0. VHP

IMAC B1 - 20 мМ Трис HCl, 500 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, 0,1% полисорбат 20, 1

мМ ЭДТА, 10 мМ GSH, 10% глицерин, pH=5,0.

Разработка процесса ионообменной хроматографии для тонкой очистки белков Е7-

БТШ70

Известно использование ионообменной хроматографии при очистке Е7-БТШ65.

Расчётное

значение

рI, полученное

при

помощи

интерактивной

программы

Protein Calculator v3.3, составило 5,05 для Е7(16)-БТШ70 и 5,18 для Е7(18)-

БТШ70. Изоэлектрическое

фокусирование

позволило

оценить

значения pI,

приблизительно

равными 5,0 для

белков

обоих

типов. В

этой

связи

для

дополнительной очистки было решено использовать анионообменную хроматографию,

обеспечивающую сорбцию Е7-БТШ70 при кислых значениях pН, тестируя сорбенты Q

HP Sepharose и YMC BioPro Q30, отличающиеся размером гранул.

Раствор целевого белка с предыдущей стадии наносили на колонны, промывали

480 мл буфера VHP Q A1: 20 мМ Трис HCl, 0.1% полисорбат 20, pH 8.0. Элюцию с

колонны осуществляли градиентом из буфера VHP Q A1 в буфер VHP Q B1: 20 мМ

Трис HCl, 1M NaCl, 0.1% полисорбат 20, pH 8.0. Сравнение результатов очистки

продемонстрировало лучшую разрешающую способность между целевым и примесными

пиками для сорбента Q HP Sepharose. Контроль чистоты фракций показал, что при

13

этим, введение

глицерина

позволило

перевести

значительное

количество

низкомолекулярных примесей в

нулевой объём. Чистота целевой фракции

была

оценена приблизительно равной 85% при содержании олигомерных форм 10%. Выход

процесса после введения дополнительных компонентов в буферные растворы VHP

IMAC изменился несущественно и составил 1240 мг и 1430 мг для белков 16 и 18

типов соответственно.

Таблица 2.

Влияние величины рН буферных

растворов при проведении

доочистки на Q HP Sepharose

на эффективность очистки

Е7(16)-БТШ70.

* на уровне

чувствительности метода.

Наличие

мономера в

нулевом

объёме

-

-

-

-

-

+-*

Поглощение в

VHP Q рН

нулевом

A, B

объёме, мAU

2 8,0

0,1

3 6,5

6,0

4 6,0

7,3

5 5,5 7,68

6 5,2 8,75

7 5,0 8,71

8 4,8 9,77

Чистота

целевой

фракции, %

~90,0%

~90,5%

~90,7%

~91,1%

~92,8%

~97,0%

удалении ЭДТА и GSH из буферных растворов Е7(16)-БТШ70 повторно подвергается

олигомеризации. В

этой

связи, в

буферные

растворы

по

аналогии

с

первой

стадией очистки вносили 10 мМ GSH и 1мМ ЭДТА (VHP Q A2, B2). Показано, что

использование буферных растворов VHP Q A2 и B2 позволяет увеличить чистоту

целевого белка до 90% при остаточном количестве олигомеров, не превышающем 6%

(рисунок 6).

Для увеличения степени чистоты материала было решено подвергнуть его

доочистке на этом же сорбенте при пониженных значениях рН с целью перевода

низкомолекулярных

примесей

в

нулевой

объём. «Закисление» проводили

с

использованием буферных растворов со значениями рН от 8,0 до 4,8, в качестве

материала нанесения использовали элюат первичной очистки на Q HP Sepharose.

Результаты

оценивали

по

показателям

чистоты

целевых

фракций, среднему

поглощению в нулевом объёме и по наличию в нулевом объёме мономерной формы

целевого белка (таблица 2).

+

-

Было

определено, что

при

значении

рН

буферных

растворов

равном 5.0

(буферные растворы VHP Q A7, B7), практически все примесные белки переходят в

нулевой

объём, чистота

суммарной

целевой

фракции

составляет

более 95%,

приблизительное

содержание

олигомеров - 4% (рисунок 5). Итоговый

состав

буферных растворов VHP Q представлен следующим образом: VHP Q A2 - 20 мМ Трис

HCl, 0.1% полисорбат 20, 10 мМ GSH, 1мМ ЭДТА, pH 8.0; VHP Q B2 - 20 мМ Трис

HCl, 1M NaCl, 0.1% полисорбат 20, 10 мМ GSH, 1мМ ЭДТА, pH 8.0.

Для перевода Е7-БТШ70 в буфер хранения проводили концентрирование на Q HP

Sepharose с последующим использованием гель-фильтрационной ВЭЖХ на сорбенте

Superdex 200. В ходе финального этапа очистки было установлено, что перевод

белков в буфер АФИ не влияет на показатели чистоты белка.

Использование

анионообменной

хроматографии

позволило

значительно

сократить количество олигомерных форм и низкомолекулярных примесей. Доочистка

на

анионообменном

сорбенте

при

пониженных

значениях

рН, дополнительно

проведённая для перевода примесей в нулевой объём, позволила повысить чистоту

14

Е7(16)- Е7(18)-

БТШ70

БТШ70

100 г

100 г

1240 мг 1430 мг

1090 мг 1310 мг

1030 мг 1250 мг

980 мг

1200 мг

900 мг

1100 мг

Таблица 3.

Выходы гибридных

белков в зависимости

от стадий

хроматографической

очистки.

Наименование стадии

Клеточный лизат – исходный материал

Металл-хелат-аффинная хроматография

Анионообменная хроматография,

1ая стадия

Анионообменная хроматография,

2ая стадия

Анионообменная хроматография,

концентрирование

Гель-фильтрационная хроматография

Разработанная технология очистки во многом совпадает с опубликованными

данными для Е7 и белков теплового шока. Однако, состав буферных растворов и

диапазоны

концентраций

описаны

впервые. Важно

отметить, что

технология

одинаково применима к белкам как 16, так и 18 типа, демонстрируя значительную

схожесть их свойств.

Исследование

варианта.

стабильности композиционных составов АФИ, выбор приоритетного

Использование Е7-БТШ70 в составе готовой лекарственной формы требовало

определения

критических

параметров, влияющих

на

физико-химические

и

биологические

свойства

при

длительных

сроках

хранения. Основная

задача,

предшествующая разработке вакцины, заключалась в определении композиционного

состава субстанций Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70, гарантирующих стабильность

белков при хранении.

Для определения приемлемого диапазона рН использовались теоретические и

практические

подходы. Выпадение

белка

в

осадок

при

значении

рН, равном

значению pI, показало, что оптимальное значение рН удалено от значения рI как

минимум на ±1. Найдено, что при достижении рН 4,7 Е7(16)-БТШ70 выпадал в

осадок. Таким образом, приемлемый для хранения белков диапазон значений рН,

должен удовлетворять условию 6 ≤ рН ≤ 4. Значения рН ≤ 4 и рН ≥ 8 не

рассматривались

из-за

несоответствия

требованиям

изогидричности,

предъявляемым

к

инъекционным

препаратам. На

этом

основании

для

экспериментального

определения

влияния

рН

на

стабильность

ключевых

показателей качества был выбран диапазон рН 6 - 8.

В качестве буферного раствора использовался фосфатный буферный раствор,

как

обладающий

высокой

буферной

ёмкостью

в

указанном

диапазоне

рН. В

эксперименте

были

протестированы

восемь

опытных

серий

Е7(16)-БТШ70 со

значениями рН от 6.2 до 7.8 (рис. 7). При тестировании стабильности серий

методом «ускоренного

хранения» определяли

степень

деградации

белка,

15

целевого белка до более чем 95%. Информация по выходам гибридных белков в

зависимости от стадии процесса очистки приведена в таблице 3.

Рисунок 7.

Результаты

скрининга

рН

при

ускоренном хранении при +25 оС

в

течение 60 дней. Верхние

графики

отражают

зависимость

содержания

мономера

и

олигомерных

форм

от

срока

тестирования, нижний – падение

содержания общего белка.

04 – рН 6.2, 05 – рН 6.4, 06 –

рН 6.6, 07 – рН 6.8, 08 – рН

7.2, 09 – рН 7.4, 10 – рН 7.6,

11 – рН 7.8

Второй

этап

исследования

был

направлен

на

выбор

предпочтительных

стабилизаторов АФИ. На

основании

работ

по

установлению

природы

примесных

продуктов

была

предложена

стратегия стабилизации

АФИ, основанная

на

содержание белка и конечное значение рН. Степень деградации оценивали путем

сопоставления относительной интенсивности белковых полос мономера, олигомеров

и низкомолекулярных продуктов деградации.

Анализ чистоты и содержания белка показал, что для серий со значениям рН

6.2-6.4 и 7.8-8.0, относительное содержание мономерной формы Е7(16)-БТШ70

резко

уменьшалось, сопровождаясь

снижением

количества

общего

белка.

Параллельно

с

этим, хранение

в

диапазоне

рН 6.6 – 7.6 не

значительно

отражалось

на

стабильности

белка. Сужение

установленного

диапазона

до

значений 6.8 – 7.4 было

направлено

на

устранение

рисков, связанных

с

возможными критическими изменениями показателей качества АФИ при длительном

хранении.

включении

определённых

в

состав

компонентов, которые

препятствовали

образованию

олигомеров

и

протеканию

процесса гидролиза. Были протестированы следующие антиоксиданты: L-метионин и

ЭДТА, аминокислоты L-гистидин и L -глицин, неиногенные поверхностно-активные

вещества

полисорбат 80 и

полоксамер 188, а

также

невосстанавливающие

дисахариды D-трегалозы дигидрат и сахароза. Для тестируемых композиций было

установлено

базовое

значение

рН 7.0, натрия

хлорид

присутствовал

как

16

обязательный

компонент

буфера

В

стадии

гель-фильтрационной

хроматографии,

описание серий приведено в таблице 4.

В связи с внесением стабилизаторов было решено увеличить температуру

«ускоренного хранения» до +37

Контролируемые

показатели

соответствовали

определённым

ранее

на

этапе

установления оптимального диапазона рН.

Таблица 4.

Композиционные

составы 2 этапа

скрининга АФИ.

Показано,

что

введение

Номер серии / содержание компонента, мг/мл

13 14 15 16 17 18 19 20 21

2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8

0,86 0,86 0,86 0,86 0,86 0,86 0,86 0,86 0,86

6,72 6,72 6,72 6,72 6,72 6,72 6,72 6,72 6,72

8,77 8,77 8,77 8,77 8,77 8,77 8,77 8,77 8,77

Наименование

компонента

Е7(16)-БТШ70

NaHPO*HO

NaHPO*12HO

NaCl

ЭДТА

L-метионин

L-гистидин

Полисорбат

80

Полоксамер

188

L-глицин

Сахароза

D-трегалозы

дигидрат

-

-

-

-

-

-

-

-

0,75 -

- 0,75

- -

- -

- -

- -

- -

- -

- - - -

- - - -

0,75 - - -

- 0,005 - -

- - 0,01 -

- - - 50

- - - -

- - - -

- -

- -

- -

- -

- -

- -

50 -

- 50

аминокислот

оказывает

значительного

влияния

стабильность

белка

независимо от

не

на

их концентраций. Степень деградации белка в образцах, содержащих ЭДТА, не

позволяет

оценить

этот

компонент

как

повышающий

стабильность

субстанции.

Тестируемая

группа

поверхностно-активных

веществ

вносила

больший

вклад

в

стабильность, чем вещества, описанные ранее. Таким образом, наибольший вклад

в стабилизацию Е7(16)-БТШ70 в растворе вносят полисорбат 80, сахароза и D-

трегалозы дигидрат (рис. 8).

Третий

этап

скрининга

предполагал

использование

метода «ускоренного

хранения» при +37 оС параллельно с хранением при -20 оС и был направлен на

установление оптимального состава АФИ белков 16 и 18 типов. Использование

повышенных температур позволяет значительно ускорить разработку, однако, не

учитывает

влияние

криопротекторов

на

стабильность

белков

при

замораживании.

Окончательное установление стабильности АФИ может опираться только на

данные

по

долгосрочной

стабильности. В

эксперименте

сравнивалось

влияние

комбинаций сахарозы и полисорбата 80. Было решено отказаться от тестирования

D-трегалозы дигидрата, аналогичного по свойствам сахарозе и менее доступного

при промышленном производстве. Результаты показали увеличение стабильности

серий при увеличении количества вносимых стабилизаторов. Хранение АФИ при -20

оС

в

течение 12 месяцев

продемонстрировало, что

только

составы,

стабилизированные комбинацией сахарозы и полисорбата 80 способны обеспечить

надёжную сохранность белков. Составы, стабилизированные полисорбатом 80 или

сахарозой, показали несоответствия по показателям «чистота» и «количественное

определение» на 12 месяце тестирования.

17

о

С, срок тестирования продлить до 80 дней.

2 4 2

2 4 2

Долгосрочные испытания показали, что компонентный состав, определённый

для

АФИ

Е7(16)-БТШ70, подходит

и

для

субстанции

белка

Е7(18)-БТШ70,

подтверждая близость их физико-химических свойств.

Долгосрочное изучение стабильности АФИ.

В

соответствии

с

международными

и

отечественными

требованиями

стабильность АФИ была продемонстрирована на трёх опытно-промышленных сериях.

Изменения показателей качества тестировали с периодичностью в 3 месяца в

течение 12 месяцев с последующим продлением тестирования до 15 месяцев для

подтверждения заявленного срока годности.

Для оценки остаточных белков штамма-продуцента Saccharomyces сerevisieae

после очистки гибридных белков использовали метод иммуноферментного анализа,

доступный в виде

коммерческих наборов Saccharomyces cerevisiae HCP ELISA

Assay (Cygnus Technology). Было показано, что остаточные белки не превышают

установленную

спецификацией

норму

как

при

выпуске

серий, так

и

при

долгосрочных исследованиях. Контроль ДНК штамма-продуцента с использованием

системы Threshold, также показал соответствие разработанной спецификации.

Для оценки остаточного никеля, способного вымываться с матрицы металл-

хелат-аффинного сорбента в процессе очистки, в спецификацию был включен метод

атомно-адсорбционной спектрометрии. Определено, что никель содержится в АФИ

18

Рисунок 8. Результаты скрининга

компонентного состава при ускоренном

хранении при +37 оС в течение 80 дней.

Верхние графики отражают зависимость

содержания мономера и олигомерных форм

от срока тестирования, нижний – падение

содержания общего белка.

В

ходе

изучения

стабильности белков Е7-БТШ70

в растворе было показано, что

при

значениях

рН, выходящих

из

диапазона 6.8-7.4

происходит гидролиз белков до

низкомолекулярных

примесей.

Комбинация 50 мг/мл сахарозы

и 0,005 мг/мл полисорбата 80,

позволила получить стабильные

АФИ, сохраняющие

показатели

качества

в

пределах

спецификации

в

течение 12

месяцев при хранении на -20

о

С.

(~0,002 мкг/мл), однако, его количества удовлетворяют нормированным значениям

спецификации (0,2 мкг/мл). Исследование

стабильности

АФИ 16 и 18 типов

показало соответствие разработанных показателей качества нормам спецификации.

Выбор первичной упаковки АФИ.

Стерильные

пластиковые

контейнеры

из

полиэтилентерефталат-гликоля

номинальным объёмом 5, 30 и 250 мл с крышкой из полиэтилена высокой плотности

производства Nalgene были выбраны на основании полученного ранее опыта в

разработке АФИ, подлежащих замораживанию. Известно, что хранение замороженных

растворов в стеклянной таре провоцирует риски появления трещин и последующей

контаминации АФИ.

Контейнеры производятся в чистых помещениях, сертифицированных по ISO

14644-1, соответствуя требованиям USP, EP и JP, предъявляемым к пластиковой

фармацевтической

упаковке. Совместимость

материала

первичной

упаковки

с

компонентами

АФИ

исследована

в

ходе

изучения

стабильности. Соответствие

требованиям нормативных документов, устойчивость контейнеров к замораживанию,

наряду данными по стабильности обосновывают использование контейнеров ПЭТФ в

качестве первичной упаковки АФИ 16 и 18 типов.

Разработка

готовой

лекарственной

формы

для

лечения

заболеваний,

ассоциированных с ВПЧ 16 и 18 типов.

При

разработке

компонентного

состава

ГЛФ

за

основу

взяли

ранее

разработанный состав АФИ, как обеспечивающий стабильное хранение гибридных

белков. Известно, что

при

оценке

иммуногенности

вакцин

ВПЧ

ключевыми

показателями

являются

активация

макрофагов, NK-клеток, цитотоксических

Т-

лимфоцитов

и

образование

цитокинов. Предполагается, что

участие

белка

теплового шока в презентации антигена Е7 Т-лимфоцитам должно стимулировать

иммунный ответ системы приобретённого Т-клеточного иммунитета. Для усиления

иммунного

ответа

путём

активации

гуморального

механизма

было

предложено

протестировать три специфичных адъюванта – гидроокись алюминия, АдъюплексTM и

Титер

типов.

Макс ГолдTM. Прививочная доза составила по 100 мкг для белков обоих

← Рисунок 9. Оценка сорбционной ёмкости гидроокиси

алюминия в отношении гибридных белков.

Для

оценки

оптимального

соотношения «белок / адъювант»

определяли

сорбционную

ёмкость

гидроокиси

алюминия

в

отношении

исследуемых

белков

при

следующих

массовых

соотношениях «белок /

адъювант»: 0/1, 0.65/1, 1.0/1, 1.3/1,

2.0/1, 2.5/1.

19

Показано, что при достижении соотношения «1,3/1» белок полностью сорбируется

на гидроокись алюминия (рис. 9). В дальнейшем использовано соотношение «2/1»,

как обеспечивающее сорбцию Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70 на адъювант.

В сравнительном исследовании иммунологических свойств белков Е7-БТШ70 и

их комбинаций с адъювантами, направленном на обоснование введения в состав

вакцины адъювантов, проводили однократную иммунизацию мышей линии С57BL/6.

Анализ экспрессии клеточных рецепторов проводили при помощи специфических

маркеров. Вакцина для лечения заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 16 и 18

типов, должна обеспечивать стимуляцию Т-клеточного иммунитета в отношении

онкобелка

Е7, направленную

на

подавление

уже

присутствующей

в

организме

инфекции и элиминацию вируса из организма.

Рисунок 10. Экспрессия клеточных маркеров после однократного введения тестируемых композиций мышам линии

С57BL/6. CD14/F4/80 – маркер моноцитов, прошедших окончательную дифференцировку, CD4 – маркер Т-хелперов,

CD8 – маркер цитотоксических Т-лимфоцитов, CD4/IFNy – маркер Т-хелперов 1 типа, CD3/NK1.1 – маркер

натуральных киллеров. Е7 – раствор гибридных белков Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70, Al – раствор гидроокиси

алюминия, - суспензия гибридных белков, сорбированных на гидроокись алюминия, ADJ – эмульсия гибридных

белков и Адъюплекс, TMG - эмульсия гибридных белков Титер Макс Голд.

Определено, что

несмотря

на

значительную

экспрессию

Т-хелперов,

цитотоксических Т-лимфоцитов и гамма интерферона в селезёнке, приходящуюся на

14 сутки после введения, раствор белков без адъюванта не способен обеспечить

стимуляцию продолжительного иммунного ответа, демонстрируя низкие показатели

при контроле на 21 сутки (рис. 10). Фармакодинамический эффект, достигаемый

при введении раствора гидроокиси алюминия, также является непродолжительным.

На

этом

фоне, сорбция

Е7-БТШ70 на

гидроокись

алюминия

обеспечивает

выраженную

стимуляцию

иммунитета

вплоть

до 21 суток, включая

основные

исследуемые маркеры. Композиции, содержащие Адъюплекс и ТитерМакс Голд, не

способны

стимулировать

экспрессию

цитотоксических

Т-лимфоцитов, обладая

низкими значениями также и по остальным исследуемым показателям. Полученные

20

Монографии

международных

фармакопей

BP JP EP USP

Международные

списки

парентеральных

ингредиентов

CSM

NNHPD

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

Вспомогательное

вещество

Натрия

дигидрофосфат

моногидрат

Натрия

гидрофосфат

додекагидрат

Натрия хлорид

Сахароза

Полисорбат 80

Гидроокись

алюминия

Пищевые

GRAS добавки

ЕС

FDA, IID

инъекционные,

инфузионные,

офтальмологические,

оральные, местные и

вагинальные формы

инъекционные,

инфузионные, назальные,

офтальмологические,

ушные, оральные, местные

и вагинальные формы

инъекционные,

ингаляционные,

назальные,

офтальмологические,

ушные, оральные, местные

и ректальные формы

инъекционные, оральные и

местные формы; растворы,

сиропы, таблетки.

внутримышечные,

внутривенные,

пероральные, ректальные,

местные и вагинальные

формы

+ - + + +

+ + + + +

+ + + + +

+ + + + +

+ + + + +

- - + - +

результаты

послужили

основанием

для

введения

в

состав

вакцины

адъюванта

гидроокиси алюминия в содержании 400 мкг/доза.

Обоснование выбора вспомогательных веществ.

При выборе вспомогательных веществ необходимо учитывать их совместимость

с действующей молекулой, другими вспомогательными веществами, а также влияние

на терапевтическую эффективность и безопасность при введении пациенту.

Наиболее

вероятными

вариантами

взаимодействий

вспомогательных

веществ

друг с другом являются взаимодействия типа «гидроокись алюминия – фосфат

ионы». Известно, что

нулевой

заряд

гидроокиси

алюминия

уменьшается

в

зависимости

от

молярности

фосфат – ионов. Вместе

с

тем, при

изучении

сорбционной

ёмкости

адъюванта

было

показано, что

тотальная

концентрация

фосфат – ионов, равная 25 мМ, не является критической и не способна влиять на

глубину сорбции. Окончательный вывод по совместимости вспомогательных веществ

между собой и с белками Е7-БТШ70 основан на данных по стабильности АФИ и ГЛФ

при хранении.

+

+

-

-

+

-*

-*

Таблица 5. Регуляторный статус вспомогательных веществ, входящих в состав вакцины.

* - допущен к использованию в парентеральных вакцинах для человека и животных в Европе и США

Выбранные

ВВ

являются

безвредными

в

предложенных

концентрациях,

обеспечивают

стабильность

действующих

веществ

и

допущены

к

применению

в

парентеральных препаратах рядом международных регуляторов.

Выбор первичной упаковки ГЛФ

Для фасовки ГЛФ были выбраны стеклянные вакцинные шприцы предварительного

наполнения с длиной иглы 1" и диаметром иглы 25G (GERRESHEIMER BUNDE GmbH), в

качестве элемента укупорки использовали эластомерный плунжер с полистироловым

21

поршнем. Выбор шприцев предварительного наполнения напрямую связан с

медицинским применением препарата, дозировкой и способом введения.

Номинальный объём, составляющий 1,0 мл, выбран на основании однократной дозы,

равной 0,5 мл.

Наиболее совместимой с различными возрастными категориями пациентов

является игла длиной 1". Диаметр 25G, наибольший из рекомендованных для в/м

вакцинации, обеспечивает надлежащее введение сорбированных препаратов широким

возрастным группам. Все компоненты первичной упаковки ГЛФ соответствуют

требованиям текущих версий USP, EP и JP.

Наиболее критическими показателями качества, указывающими на влияние

упаковки на свойства препарата, как и в случае АФИ, являются рН и содержание

полисорбата 80. Сорбция белка на стенках цилиндров шприца контролировалась

косвенным образом, на основании оценки содержания белка в надосадочной

жидкости после сорбции антигенов на адъювант. Соответствие требованиям

нормативных документов, наряду данными по стабильности обосновывают

использование шприцев RTF в качестве первичной упаковки вакцины.

Долгосрочное изучение стабильности ГЛФ.

Наиболее типичными показателями при изучении стабильности являются

активность, чистота и подлинность. Другие характеристики продукта не являются

специфичными для биологической продукции, но они также подлежат мониторингу и

должны включаться в итоговые данные по исследованию ГЛФ.

В соответствии с разработанным проектом ФСП на вакцину было проведено

исследование стабильности трёх опытно-промышленных серий по показателям

проекта ФСП. Ключевой показатель «биологическая активность», подтверждающий

подлинность и иммуногенность вакцины обычно проходит разработку на финальном

этапе доклинических исследований. К моменту написания настоящей работы

разработка метода не была проведена, однако, косвенным методом контроля

подлинности может являться дополнительный метод, введённый в проект ФСП и

подтверждающий сохранение антигенных свойств белков – «вестерн блоттинг после

десорбции». Установлено, что тестируемые показатели качества трёх серий

вакцины соответствуют заявленным требованиям НД на протяжении всего срока

хранения с продлением до трёх месяцев при хранении на заявленной температуре

2-8 оС, что подтверждает стабильность вакцины.

22

Буферные растворы: VHP IMAC A: 20 мМ трис-HСl, 30 мМ

имидазол, 500 мМ NaCl, 0,1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10

мМ L-глутатион, pH=8,0; VHP IMAC B: 20 мМ трис-HСl, 500 мМ

имидазол, 500 мМ NaCl, 0,1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10

мМ L-глутатион, 10% глицерин, pH=8,0

Буферные растворы: VHP Q A1: 20 мМ трис-HCl, 0.1%

полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ L-глутатион, pH 8.0; VHP Q

B1: 20 мМ трис-HCl, 0.1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ

L-глутатион, 1M NaCl, pH 8.0

Буферные растворы: VHP Q A2: 20 мМ трис-HCl, 0.1%

полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ L-глутатион, pH 8.0; VHP Q

B2: 20 мМ трис-HCl, 0.1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ

L-глутатион, 1M NaCl, pH 5.0

Буферные растворы VHP Q CONC A: 20 мМ трис-HCl, 10

мМ L-глутатион, 1 мМ ЭДТА, 0,1 % полисорбат 20, pH 8,0;

VHP Q CONC B: 20 мМ трис-HCl, 50 мМ L-глутатион, 1 мМ

ЭДТА, 0,1% полисорбат 20, pH 8,0.

Буферный

раствор VHP SE: натрия

дигидрофосфат

моногидрат 0,86 мг/мл, натрия гидрофосфат додекагидрат

6,72 мг/мл, натрия хлорид 8,77 мг/мл, сахароза 50 мг/мл,

полисорбат 80 0,005 мг/мл, pH 7.0

Буферный

раствор

АФИ: натрия

дигидрофосфат

моногидрат 0,86 мг/мл, натрия гидрофосфат додекагидрат

6,72 мг/мл, натрия хлорид 8,77 мг/мл, сахароза 50 мг/мл,

полисорбат 80 0,005 мг/мл, pH 7.0

Контейнеры пластиковые из полиэтилентерефталата с

полипропиленовой крышкой номинальным объёмом 5, 30, 60 и

125 мл.

В соответствии с проектом ФСП на субстанции Е7-БТШ70

В соответствии с проектом ФСП на субстанции Е7-БТШ70

Вспомогательные

вещества - натрия

дигидрофосфат

моногидрат, натрия гидрофосфат додекагидрат, натрия

хлорид, сахароза, полисорбат 80, соответствующие текущей

версии Eur.Ph.

Буферный

раствор

ГЛФ: натрия

дигидрофосфат

моногидрат 0,86 мг/мл, натрия гидрофосфат додекагидрат

6,72 мг/мл, натрия хлорид 8,77 мг/мл, сахароза 50 мг/мл,

полисорбат 80 0,005 мг/мл, pH 7.0,

Раствор гидроокиси алюминия, 10 мг/мл до конечной

концентрации в ГЛФ 0,8 мг/мл

Шприцы предварительного наполнения из

боросиликатного стекла I-го гидролитического класса,

укупоренные бромбутиловым плунжером, закрытые колпачком из

полипропилена со вставкой из резины.

В соответствии с проектом ФСП на ГЛФ

В соответствии с проектом ФСП на ГЛФ

23

Сорбент IMAC

Sepharose FF,

система AKTA

Purifier 100,

колонна объёмом 0,4

л, 2-8 оС

Сорбент Q HP

Sepharose, система

AKTA Purifier 100,

колонна объёмом 0,1

л, 2-8 оС

Сорбент Q HP

Sepharose, система

AKTA Purifier 100,

колонна объёмом 0,1

л, 2-8 оС

Сорбент Q HP

Sepharose, система

AKTA Purifier 100,

колонна объёмом 0,1

л, 2-8 оС

Сорбент Superdex

200, система AKTA

Purifier 100,

колонна объёмом

0,12 л, 2-8 оС

Реакционная

ёмкость, мешалка

магнитная, 2-8 оС

Машина розлива

Groninger DFH

Реакционная

ёмкость, мешалка

магнитная, 2-8 оС

Машина розлива

Groninger DFH

Клеточный лизат

гибридных белков

Е7-БТШ70

Металл-хелат

аффинная

хроматография

Анионообменная

хроматография

Анионообменная

хроматография

Концентрирование

на

анионообменном

сорбенте

Гель-

фильтрационная

хроматография

Нормирование

концентрации

субстанции

Розлив

субстанции

Упаковка,

маркировка,

субстанции

Выходной

контроль

субстанции в

соответствии с

ФСП

Приготовление

буфера готовой

лекарственной

формы

Приготовление

готовой

лекарственной

формы

Розлив готовой

лекарственной

формы

Упаковка,

маркировка

готовой

лекарственной

формы

Выходной

контроль готовой

лекарственной

формы

Технологическая схема процесса производства вакцины

Затраты

Материальные затраты

Фонд оплаты труда

Страховые взносы

Амортизационные отчисления

Охрана окружающей среды, командировки,

юридические услуги, реклама

Итоговая сумма затрат

Затраты/год, тыс. руб.

Доля, %

2 272,99

29,88

990,50

13,02

336,77

4,43

2738,99

36,01

1 267,85

16,67

7 607,10

100,00

Себестоимость упаковки рассчитывается путём деления итоговой суммы затрат

на производственную потребность:

7 607 100,00/7000 = 1086,73 руб/упаковка

Стоимость

Гардасил

на

рынке

РФ

оценивается

равной 5818,00 руб/уп,

стоимость Церварикс - 4591,00 руб/уп. При себестоимости вакцины Е7-БТШ70

1086,73 руб/уп, её

производство

является

экономически

ВЫВОДЫ

составляющей

эффективным.

Экономическая эффективность производства вакцины

Известно, что за 9 месяцев 2011 года в РФ было продано 518 упаковок

Церварикс и 5591 упаковок Гардасил. За аналогичный период 2012 года продажи

Церварикс составили 2873 упаковки, Гардасил – 5880 упаковок. Оценка продаж

ВПЧ-вакцин на период 2016-2020 г.г. позволяет ориентироваться на 20000 –

30000 уп/год. Упрощённо принимая долю вакцины Е7-БТШ70 как треть от общего

рынка, ориентировочная производственная потребность составит 7000 уп/год.

Итоги расчёта годовых затрат на производство и реализацию вакцины Е7-

БТШ70 изложены в таблице 6. Расчёт адаптирован под производственные мощности

ОАО «Фармстандарт Уфа-Вита» и ООО «ФАРМАПАРК», обеспеченные подавляющей

частью необходимого оборудования и материалов; предприятия лицензированы на

производство ГЛФ и АФИ.

Таблица 6. Смета годовых затрат на производство и реализацию вакцины Е7-БТШ70

1. Проведена идентификация примесного профиля, присутствующего в целевых

фракциях

Е7(16)-БТШ70 и

Е7(18)-БТШ70 после

очистки

металл-хелат-аффинной

хроматографией. Установлено, что

низкомолекулярные

примеси

представлены

продуктами деградации целевого белка и фрагментами белков штамма-продуцента

Saccharomyces cerevisiae, высокомолекулярные

примеси – продуктами

олигомеризации Е7-БТШ70.

2. Антигенные

и

иммуногенные

свойства

выделенных

гибридных

белков

охарактеризованы

методами

вестерн

блоттинга

и

проточной

цитофлюориметрии.

Показано сохранение характеристик подлинности при долгосрочном хранении, что

свидетельствует о поддержании пространственной структуры гибридных белков и

доступности ключевых эпитопов, определяющих их иммуногенные свойства.

3. Оптимизированы

условия

хроматографической

очистки

на

металл-хелат-

аффинном сорбенте с использованием буферных растворов VHP IMAC: VHP IMAC A1 -

24

20 мМ Трис HCl, 30 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 0,1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА,

10 мМ GSH, 10% глицерин, pH=8,0. VHP IMAC B1 - 20 мМ Трис HCl, 500 мМ

имидазол, 500 мМ NaCl, 0,1% полисорбат 20, 1 мМ

ЭДТА, 10 мМ GSH, 10%

глицерин, pH=8,0. Оптимизация

компонентного

состава

буферных

растворов

позволила увеличить чистоту целевых форм Е7-БТШ70 на 15%.

4. Введение стадии анионообменной хроматографии в буферных растворах VHP Q

A2 - 20 мМ Трис HCl, 0.1% полисорбат 20, 10 мМ GSH, 1мМ ЭДТА, pH 8.0 и VHP Q

B2 - 20 мМ Трис HCl, 1M NaCl, 0.1% полисорбат 20, 10 мМ GSH, 1мМ ЭДТА, pH 8.0

с последующим концентрированием и переводом в буфер АФИ гель-фильтрационной

ВЭЖХ, позволило получить целевые белки с чистотой, превышающей 95%.

5. Показано, что хранение Е7-БТШ70 в 25 мМ фосфатном буферном растворе при

рН 6.8-7.4, стабилизированном 50 мг/мл сахарозой, 8,77 мг/мл хлоридом натрия

и 0,005 мг/мл полисорбатом 80, при температуре -20 оС субстанция сохраняет

специфицируемые показатели качества в течение 12 месяцев.

6. По результатам сравнительных исследований подобран эффективный адъювант

гидроокись

алюминия, стимулирующий

активацию

макрофагов, натуральных

киллеров, цитотоксических Т-лимфоцитов, и также способствующий образованию

цитокинов при однократном введении модельным мышам линии С57BL/6.

7. Предложенный

композиционный

состав

вспомогательных

веществ,

обеспечивающий получение стабильного, не требующего лиофилизации, препарата

позволил повысить технологичность и экономическую эффективность производства

за счёт исключения этапа лиофильного высушивания.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Разработанные

технологические

этапы

производства

и

определение

композиционного

состава

вакцины

использованы

при

наработке

активных

фармацевтических субстанций Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70 в рамках выполнения

государственных

контрактов

№ 16.N08.12.1024 и

№ 13411.1008799.13.173 от

Минобрнауки и Минпромторга России.

2. Разработанная

технология

приготовления

ГЛФ

использована

при

производстве вакцины для проведения доклинических испытаний в рамках работ по

государственным

контрактам

№ 16.N08.12.1024 и

№ 13411.1008799.13.173 от

Минобрнауки и Минпромторга России.

3. Разработаны и утверждены опытно-промышленные регламенты на

производство вакцин под № 00479942-03-14 и № 00479942-01-15.

РЕКОМЕНДАЦИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

1. Рекомендовать разработанные технологические этапы хроматографической

очистки, включая составы буферных растворов и денатурирующих агентов для

лабораторного и промышленного выделения рекомбинантных антигенов семейств

папилломавирусов, аденовирусов, полиомавирусов и их конъюгированных

25

производных, получение которых затруднено наличием сильных межмолекулярных

взаимодействий.

2. Рекомендовать использование метода «ускоренного хранения» в части

рабочих температур и продолжительности этапов тестирования для определения

композиционного состава АФИ, содержащих рекомбинантные белки в качестве

действующих веществ.

3. Рекомендовать описанные технологические этапы и методологию

исследования для разработки биотехнологических лекарственных препаратов для

ветеринарного применения.

4. Вакцину, в ходе проведения доклинических исследований, изученную по

показателям острой и хронической токсичности, специфической токсичности

(репродуктивности, генотоксичности, мутагенности) рекомендовать для

проведения клинических испытаний.

5. Методологию и программу фармацевтической разработки АФИ и ГЛФ

рекомендовать к использованию в учебном процессе при подготовке студентов

биотехнологической и биохимической специальностей ВУЗов медицинского и

ветеринарного направления.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Жученко

М.А. Выделение

и

идентификация

гибридного

рекомбинатного

онкопротеина Е7 вируса папилломы человека 16 типа конъюгированного с белком

теплового шока 70 / Жученко М.А., Шамонов Н.А., Серебрякова М.В., Черепушкин

С.А. // Биотехнология – 2015. - №1 – С. 29 – 37.

2. Жученко

М.А. Разработка

компонентного

состава

активных

фармацевтических субстанций на основе гибридных рекомбинантных белков Е7-

БТШ70 / Жученко М.А., Гаврилова Н.А., Черепушкин С.А., Клишин А.А., Кухаренко

А.Е. // Биотехнология – 2015. - №1 – С. 38 – 48.

3. Жученко М.А. Технология очистки гибридных рекомбинантных онкопротеинов

Е7 вируса

папилломы

человека 16 и 18 типов, конъюгированных

с

белком

теплового шока 70 / Жученко М.А., Шамонов Н.А., Черепушкин С.А., Гаврилова

Н.А. // Биотехнология – 2015. - №2 – С. 13 - 25.

4. Жученко М.А. Стабилизация гибридного белка на основе рекомбинантного

интерферона

альфа 2b / Жученко

М.А., Рябиченко

В.В., Санникова

Е.П. //

Биофармацевтический журнал - 2015. - Т. 7. - № 6. - С. 56 – 62.

5. Кухаренко

А.Е. Разработка

терапевтических

вакцин

на

основе

рекомбинантных белков E7 вируса папилломы человека и белка теплового шока для

иммунотерапии заболеваний аногенитальной области / Кухаренко А.Е., Гаврилова

Н.А., Леонов В.С., Селищев С.В., Жученко М.А., Козлов Д.Г., Хамитов Р.А. //

Материалы

Международной

научно-практической

конференции «Биотехнология

и

качество жизни» 18-20 Марта 2014 г. М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ

им. Д.И. Менделеева, 2014. стр. 202.

26



 
Похожие работы:

«УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ВИТЕБСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ УДК 618.145:616-007.61-07-084 ЛЫСЕНКО Ольга Викторовна ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ЭНДОМЕТРИЯ: КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА, ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.01.01 – акушерство и гинекология Витебск, 2015 Официальные оппоненты: Оппонирующая организация: Воскресенский Сергей Львович, доктор медицинских наук, профессор,...»

«Хазиахматова Ольга Геннадьевна РОЛЬ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ В ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ Т-ЛИМФОЦИТОВ: МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТЫ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2015 1 доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии ФГБОУ Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической...»

«ШВЫРЕВА УЛЬЯНА СЕРГЕЕВНА СТРУКТУРНО-ФЦНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕГУЛЯТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА dps E. coli 03.00.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пущино-2016 доктор биологических наук, профессор Озолинь Ольга Николаевна кандидат биологических наук Тутукина Мария Николаевна доктор биологических наук, профессор Гельфанд Михаил Сергеевич (заместитель директора по научным Научные руководители: Официальные оппоненты:...»





 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.