авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ»

УДК 602.4+604.4+606:62+579.66+579.832/.833

БОЛОТНИК

Елена Валерьевна

ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОБУТАНОЛА

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОТСЕЛЕКТИРОВАННОГО ШТАММА

CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM БИМ В-709 Д

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

по специальности 03.01.06 – биотехнология (в том числе

бионанотехнологии)

Минск 2015

2

Научная работа выполнена в Государственном научном учреждении «Институт

микробиологии Национальной академии наук Беларуси»

Научный руководитель:

Коломиец

Эмилия

Ивановна,

доктор

биологических

наук,

член-корреспондент

Национальной

академии

наук

Беларуси,

директор

государственного

научного

учреждения

«Институт

микробиологии

Национальной академии наук Беларуси»

Официальные оппоненты:

Дебабов

Владимир

Георгиевич,

доктор

биологических

наук,

академик

Российской

академии

наук,

профессор,

научный

руководитель

Государственного

научного

центра

Российской

Федерации

ФГУП

«Государственный

научно-исследовательский

институт генетики и селекции промышленных

микроорганизмов»

Ручай

Николай

Степанович,

кадидат

технических

наук,

доцент

кафедры

биотехнологии

и

биоэкологии

факультета

технологии органических веществ Учреждения

образования

«Белорусский

государственный

технологический университет»

Оппонирующая организация:

Белорусский государственный университет

Защита состоится «30» июня 2015 г. в 9.30 на заседании совета по защите

диссертаций

Д

01.34.01

при

Государственном

научном

учреждении

«Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси» по адресу:

220141, г. Минск, ул. акад. В.Ф. Купревича, 2, тел.: (+375-17) 267-62-09,

факс: (+375-17) 267-47-66, e-mail: microbio@mbio.bas-net.by

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного

научного учреждения «Институт микробиологии Национальной академии наук

Беларуси»

Автореферат разослан «26» мая 2015 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций,

кандидат биологических наук

Т.В. Семашко

1

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы диссертации. В последние годы большой интерес

среди альтернативных источников энергии вызывает биобутанол – продукт

анаэробной ферментации возобновляемого углеводсодержащего сырья соль-

вентогенными бактериями рода Clostridium. Преимущества биобутанола обу-

словлены его высокой энергоемкостью, хорошей смешиваемостью, высоким

октановым числом, низкой летучестью, технологичностью применения. Из-

вестно, что использование биобутанола в качестве добавки к моторному топ-

ливу улучшает характеристики горения, позволяет сократить вредные выбро-

сы и увеличить ресурс двигателей внутреннего сгорания. Благодаря сравни-

тельно низкому содержанию кислорода в молекуле бутанола (21,6 % против

34,8 % для этанола), концентрация его в топливных смесях может быть су-

щественно выше, чем большинства известных оксигенатов (Ramey, 2007; Де-

бабов, 2008; Szulczyk, 2010). Важно отметить, что биобутанол может приме-

няться не только в качестве моторного топлива, но и как промышленный рас-

творитель, исходное сырье для получения пластификаторов, смол, как реа-

гент в синтезе многих органических веществ, что является дополнительным

стимулом к его производству (Ramey, 2007).

Вместе с тем, биотехнологический способ производства бутанола, поз-

воляющий, в отличие от химического, получить более качественный и эколо-

гически безопасный продукт, пока недостаточно эффективен, что обусловле-

но высокой стоимостью питательных сред, токсичностью целевого метабо-

лита для штамма-продуцента и, как следствие, низкой продуктивностью

ферментационного процесса, а также энергоемкостью технологии выделения

бутанола из среды культивирования (Ramey, 2007).

В связи с указанным, актуальным является получение штамма бактерий

с высокой продуктивностью по бутанолу, устойчивостью к неблагоприятным

факторам окружающей среды, и разработка на его основе конкурентоспособ-

ной технологии получения биобутанола.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Связь работы с научными программами (проектами), темами. Дис-

сертационная

работа

выполнена

в

рамках

государственной

научно-

технической программы «Химические технологии и производства» по теме:

«Разработать технологию получения топливного биобутанола из возобновля-

емого растительного сырья и смесевого моторного биотоплива на его основе.

Разработать стандарт Республики Беларусь на новый вид смесевого моторно-

2

го биотоплива для бензиновых двигателей», № госрегистрации 20090044

(2008-2010 гг.); межгосударственной целевой программы ЕврАзЭС «Инно-

вационные биотехнологии» по темам: «Разработать и освоить опытно-

промышленную технологию получения биобутанола, основанную на ис-

пользовании высокоактивных штаммов микроорганизмов – продуцентов и

дешевого возобновляемого сырья», № госрегистрации 20112751 (2011-

2013 гг.), «Сконструировать высокопродуктивный штамм бактерий рода

Clostridium с целью усовершенствования технологии производства биобута-

нола», № госрегистрации 20131689 (2013-2015 гг.); гранта Всемирной феде-

рации ученых на период 17.10.2013-17.10.2014 для выполнения работ по теме

«Selection of Clostridium acetobutylicum strain and optimization of acetone-

butanol-ethanol fermentation to increase its efficiency».

Тема диссертационной работы соответствует следующим разделам пе-

речня приоритетных направлений фундаментальных и прикладных исследо-

ваний в Республике Беларусь на 2011-2015 годы: 1.5. «Использование возоб-

новляемых источников энергии, вторичных энергоресурсов и местных видов

топлива», 3.7. «Микробные технологии и препараты для пищевой и легкой

промышленности, сельского, лесного хозяйства, медицины и охраны окру-

жающей среды»; 3.9. «Технологии производства биотоплива из биомассы

энергоинтенсивных растительных культур, отходов промышленного и сель-

скохозяйственного производств», утвержденного постановлением Совета

Министров Республики Беларусь № 585 от 19.04.2010 г.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования явля-

лось получение высокоактивного штамма-продуцента и разработка на его

основе технологии получения биобутанола.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

методом адаптивной селекции получить штамм сольвентогенных

бактерий C. acetobutylicum с высокой продуцирующей способностью;

исследовать физиолого-биохимические свойства отселектированного

штамма и выявить факторы, определяющие его устойчивость к бутанолу;

оптимизировать условия получения посевного материала бактерий

C. acetobutylicum;

разработать питательные среды для ацетонобутилового брожения на

основе возобновляемого сырья и отходов спиртового производства;

оптимизировать процесс ацетонобутилового брожения в условиях

периодического и отъемно-доливного культивирования C. acetobutylicum;

разработать технологию получения биобутанола с использованием

отселектированного штамма C. acetobutylicum.

3

Объект исследования – штамм C. acetobutylicum БИМ В-709 Д – про-

дуцент бутанола, полученный методом адаптивной селекции.

Предмет исследования – технология получения биобутанола.

Научная новизна. Методом адаптивной селекции получен штамм бак-

терий C. acetobutylicum БИМ В-709 Д, продуцирующий бутанол на уровне

лучших известных аналогов, и характеризующийся высокими скоростью ро-

ста, устойчивостью к стрессовым факторам, что определяет перспективность

его использования в технологии получения биобутанола.

Впервые у бактерий C. acetobutylicum БИМ В-709 Д выявлено наличие

кросс-толерантности: предварительная адаптация культуры к бутанолу

(18,5 г/л) способствует повышению устойчивости к другим стресс-факторам

– температурному, осмотическому, воздействию хлорамфеникола.

Установлено, что одним из факторов, обуславливающих стрессоустой-

чивость штамма C. acetobutylicum БИМ В-709 Д, является стабилизация кле-

точных мембран вследствие уменьшения в их составе количества ненасы-

щенных жирных кислот (S/U-коэффициент в 1,84 раза выше, чем у родитель-

ского штамма).

Впервые показано, что максимальная производительность отъемно-

доливного процесса ацетонобутилового брожения (0,62 г/л×ч) обеспечивает-

ся при использовании иммобилизованных на хлопчатобумажном полотне

бактерий C. acetobutylicum БИМ В-709 Д и скорости разбавления 0,07 ч-1.

Положения, выносимые на защиту:

1. Штамм C. acetobutylicum БИМ В-709 Д, продуцирующий бутанол на

уровне лучших известных аналогов (18,4-19,2 г/л), характеризующийся вы-

сокими скоростью роста (0,52 ч-1) и устойчивостью к стрессовым воздействи-

ям. Одним из факторов, обуславливающих повышенную резистентность от-

селектированного штамма к бутанолу, является стабилизация клеточных

мембран вследствие уменьшения в их составе количества ненасыщенных

жирных кислот (S/U-коэффициент в 1,84 раза выше, чем у родительского

штамма).

2. Оптимальные условия получения вегетативного посевного материала

C. acetobutylicum БИМ В-709 Д, обеспечивающие высокий титр жизнеспо-

собных клеток (5±0,5×109 КОЕ/мл), достигаются при глубинном выращива-

нии штамма в среде на основе ржаной муки (10 % об.) в течение 24 ч (2 по-

следовательных пассажа), температуре 37 ºС, а иммобилизованного – путем

32-часовой сорбции вегетативного инокулята на хлопчатобумажном полотне.

3. Оптимизация периодического процесса ацетонобутилового броже-

ния позволяет повысить его производительность на 39-42 %: в среде на осно-

ве фугата послеспиртовой зерновой барды – за счет сокращения длительно-

4

сти ферментации на сутки; в среде на основе ржаной муки (13 % об.) – за

счет увеличения выхода бутанола на 42 %, что обеспечивает ценовую конку-

рентоспособность биобутанола по сравнению с химическим аналогом.

4. Разработанная технология получения биобутанола, основанная на

использовании иммобилизованной культуры C. acetobutylicum БИМ В-709 Д

и отъемно-доливной ферментации со скоростью разбавления 0,07 ч-1 позво-

ляет увеличить выход бутанола от потребленного субстрата в 14 раз и про-

изводительность ацетонобутилового брожения в 2,4 раза по сравнению с пе-

риодическим процессом, что свидетельствует о перспективности ее реализа-

ции в промышленных масштабах.

Личный вклад соискателя. Автором собрана и обобщена научная ли-

тература, получены, статистически обработаны и проанализированы экспе-

риментальные данные, составляющие основу диссертационной работы. Спо-

соб выделения бутанола из культуральной жидкости клостридий разработан

совместно с сотрудниками лаборатории химии конденсированных сред

учреждения БГУ «Научно-исследовательский институт физико-химических

проблем», возглавляемой кандидатом химических наук Ю.В. Григорьевым.

Соавторами публикаций являются сотрудники лаборатории средств биологи-

ческого контроля, лаборатории «Центр аналитических и генно-инженерных

исследований» Института микробиологии НАН Беларуси, сотрудники Все-

российской коллекции промышленных микроорганизмов, а также лаборато-

рии

химии

конденсированных

сред

учреждения

БГУ

«Научно-

исследовательский институт физико-химических проблем».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы

доложены на ХІІ съезде Общества микробиологов Украины им. С.Н. Вино-

градского

(Ужгород, 2009); международных конференциях: «Биология -

наука ХХI века» (Пущино, 2009), «Биотехнология: экология крупных горо-

дов» (Москва, 2010), «Современное состояние и перспективы развития

микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2010), «Микробные биотехноло-

гии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2013), «Молодежь в

науке – 2014» (Минск, 2014), «Биотехнология и качество жизни» (Москва,

2014); международном симпозиуме «Адаптация к климатическим изменени-

ям в Балтийском регионе: вклад растений и микробных технологий» (Микке-

ли, 2010); Молодежном инновационном форуме «ИНТРИ»–2010 (Минск,

2010); международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы

развития» (Москва, 2013).

Опубликованность результатов диссертации. По материалам дис-

сертации опубликовано 15 работ, в том числе 5 статей в рецензируемых жур-

налах и сборниках, 1 статья в материалах международных конференций, 9 те-

5

зисов докладов международных конференций. Подана 1 заявка на патент. Без

соавторов опубликовано 4 работы. Общий объем опубликованных материа-

лов составляет 3,6 авторских листа, из них на статьи, соответствующие пунк-

ту 18 Положения о присуждении ученых степеней и присвоении ученых зва-

ний в Республике Беларусь, приходится 2,9 авторских листа.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,

общей характеристики работы, аналитического обзора литературы, описания

объектов и методов исследования, 3-х глав экспериментальной части, заклю-

чения, библиографического списка (248 наименований на 22-х страницах),

публикаций соискателя (15 наименований на 3-х страницах), 11 приложений

на 20 страницах. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста,

содержит 22 таблицы на 20 страницах, 23 рисунка на 22-х страницах.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Приведены имеющиеся в литературе сведения о перспективах исполь-

зования биобутанола в качестве моторного топлива и химического реагента,

описаны физиолого-биохимические свойства бактерий рода Clostridium

продуцентов бутанола, механизм и особенности ацетонобутилового броже-

ния, состояние исследований, направленнгых на повышение конкурентоспо-

собности технологии получения биобутанола.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования являлся штамм сольвентогенных

бактерий C. acetobutylicum БИМ В-709 Д, полученный методом адаптивной

селекции коллекционного штамма C. аcetobutylicum ВКПМ-5103 (БИМ

В-466) по признаку устойчивости к повышенным концентрациям бутанола.

В работе также использовали штаммы сольвентогенных бактерий вида

C. acetobutylicum, полученные из фондов Всероссийской коллекции промыш-

ленных микроорганизмов (ВКПМ) и Всероссийской коллекции микроорга-

низмов (ВКМ): ВКПМ-18, 33, 39, 102, 129, 138, 218, 638, 772, 4361, 4786,

5119, 5161, 5358, 9922, 9924, 10942; ВКМ-1787.

Для длительного хранения штаммов использовали метод лиофилиза-

ции. В лабораторных условиях бактерии поддерживали методом субкульти-

вирования в традиционной для ацетонобутилового брожения (Логоткин,

1958) питательной среде 1 состава (г/л): мука ржаная обдирная (крахмали-

стость 60 %) – 100; вода водопроводная – до 1 л; рН 6,0-7,0.

6

Адаптивную селекцию бактерий проводили путем многократных пере-

севов в среде 2 состава (г/л): глюкоза – 30,0; NH4COOH – 3,0; KH2PO4 – 1,0;

K2HPO4 – 0,8; MgSO4×7H2O – 1,0; FeSO4×7H2O – 0,05; дрожжевой экстракт –

5,0; цистеина хлорид – 0,5; вода дистиллированная – до 1 л; рН 6,0-7,0, со-

держащей бутанол в нарастающей концентрации от 1,2 до 1,85 % об. с шагом

0,05 % об.

Морфологию клеток изучали методом световой микроскопии нативных

и окрашенных по методу Шеффера-Фультона (Васильев, 2003) препаратов

при инструментальном увеличении 1×1000, используя микроскоп Kozo Optic

XJS500 (Китай).

Вегетативный посевной материал бактерий C. acetobutylicum БИМ

В-709 Д получали путем глубинного выращивания 2-х последовательных

пассажей клеток (продолжительность культивирования каждого пассажа –

24 ч) при 37 ºС в среде 1, а иммобилизованный – путем 32-часовой сорбции

вегетативного инокулята на хлопчатобумажном (х/б) полотне.

Для ацетонобутилового брожения использовали оптимизированные пи-

тательные среды состава (г/л): 3. Мука ржаная – 60,0; фугат послеспиртовой

зерновой барды – до 1 л; рН 6,0-7,0; 4. Мука ржаная – 130,0; вода водопро-

водная – до 1 л; рН 6,0-7,0. В целях понижения вязкости среды 4 проводили

ее обработку ферментными препаратами.

Периодический процесс ацетонобутилового брожения осуществляли в

лабораторных ферментерах АНКУМ-3М и АК-210 при температуре культи-

вирования (31±1) ºС, перемешивании каждые 3 ч в течение 10 мин, скорости

вращения мешалки 30 об./мин, продолжительности 48 или 72 ч для сред 3 и 4

соответственно, с использованием вегетативного посевного материала в ко-

личестве 5 % об. Отъемно-доливное культивирование проводили при скоро-

сти разбавления 0,07 ч-1 без дополнительного перемешивания с использова-

нием иммобилизованного посевного материала. Для получения иммобилизо-

ванных клеток в производственную среду вносили стерильное х/б полотно из

расчета 3,5 г носителя на 1 л среды, инокулировали вегетативным посевным

материалом (5 % об., титр - 5×109 КОЕ/мл) и культивировали при 37 ºС в те-

чение 32 ч, после чего начинали отъем-долив.

Производительность процесса по целевому продукту с единицы объема

аппарата в единицу времени Q (г/л×ч), выход бутанола от потребленного

субстрата в единицу времени q (г/г×ч), коэффициент разбавления (D) для ре-

жима отъемно-доливного культивирования рассчитывали по общепринятым

формулам (Манаков, 1990).

7

Выделение бутанола и сопутствующих растворителей из культураль-

ной жидкости (КЖ) C. acetobutylicum БИМ В-709 Д проводили путем ди-

стилляции с последующей ректификацией (Логоткин, 1958).

Анализ биохимического состава сырья для ацетонобутилового броже-

ния проводили в соответствии с методами техно-химического контроля

спиртового производства (Рухлядева, 1974; Фертман, 1975). Концентрацию

свободных редуцирующих веществ в КЖ устанавливали по методу Миллера

(Miller, 1959), общих сахаров – по методу Бертрана (Рухлядева, 1974). Общий

азот определяли по методу Кьельдаля, для пересчета на «сырой протеин» ис-

пользовали коэффициент 6,25 (Петербургский, 1986).

Выход биомассы устанавливали весовым методом после высушивания

клеток до постоянной массы при 105 ºС. Оптическую плотность бактериаль-

ной суспензии (ОП) измеряли с помощью фотоколориметра КФК-2-УХЛ4.2

(РФ) при длине волны 590±10 нм. Количество жизнеспособных клеток бак-

терий (КОЕ/мл) в КЖ определяли методом предельных разведений с после-

дующим высевом на агаризованную среду 2, количество спор (спор/мл) – тем

же методом после предварительного прогрева КЖ при 80 °С в течение10 мин

(Звягинцев и др., 1980). Учет сформировавшихся колоний проводили через

72 ч культивирования в анаэробной атмосфере при 37 °С.

Основные параметры роста бактерий (удельная скорость роста, время

генерации) рассчитывали по общепринятым формулам (Перт, 1978).

Качественный и количественный состав продуктов ацетонобутилового

брожения определяли методом газо-адсорбционной хроматографии на при-

боре «Хром-5» (Чехия) с пламенно-ионизационным детектором, на стальной

колонке длиной 270 см с внутренним диаметром 4 мм, заполненной пори-

стым полимером Porapak Q 80-100 меш. Температура термостата колонки:

изотермический режим 190 ºС в течение 6 мин. Расход газа-носителя (гелия)

– 35 мл/мин, температура инжектора и детектора – 250 ºС.

Липиды из клеточной биомассы экстрагировали методом Фолча в мо-

дификации Блайя и Дайэра (Baer,1987). Качественный и количественный со-

став метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) изучали методом хромато-

масс-спектрометрии с помощью газового хроматографа Agilent 6890N с масс-

селективным детектором Agilent 5975 Inert в режиме регистрации полного

ионного тока (Scan). Интервал масс m/z = 40-750 Да. Колонка – HP-5MS

(Agilent 19091S-433 30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм); газ-носитель – гелий. Ско-

рость потока – 0,8 л/мин. Температура испарителя – 250 °С.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени проводили

на амплификаторе MX3000P («Stratagene», Германия) в оптимизированных

условиях, используя реагенты «Thermo Scientific» (Литва) и праймеры

рассчитывали

(Livak, 2001).

с

использованием

сравнительного

порогового

метода

Статистическую обработку данных проводили с использованием про-

граммы Microsoft Excel. Рассчитывали средние величины и их доверительные

интервалы для уровней вероятности 95 %. Наименьшую существенную раз-

ность (НСР0,5) определяли с использованием дисперсионного анализа

(Рокицкий, 1973; Зворыгин, 2006).

ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА C. ACETOBUTYLICUM БИМ В-709 Д –

ПРОДУЦЕНТА БУТАНОЛА И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ

Исследована продуцирующая способность 19 штаммов бактерий вида

C. acetobutylicum, полученных из фондов ВКПМ и ВКМ, отобран штамм

C. acetobutylicum ВКПМ-5103 (БИМ В-466), характеризующийся наиболь-

шим показателем выхода бутанола (10,7±0,3 г/л) в питательной среде 1. По-

добраны условия (температура 37 °С, 24 ч), обеспечивающие получение ак-

тивных стартовых культур штамма. Установлено, что максимальный титр

C. acetobutylicum БИМ В-466 (7,5±0,5×109 КОЕ/мл) достигается при культи-

вировании в среде 1, обогащенной дрожжевым экстрактом (5 г/л) и комплек-

сом минеральных солей (г/л: NH4COOH – 3,0; KH2PO4 – 1,0; K2HPO4 – 0,8;

MgSO4×7H2O – 1,0; FeSO4×7H2O – 0,05).

Для получения бутанолтолерантного штамма сольвентогенных бакте-

рий проведена адаптация коллекционного штамма C. acetobutylicum БИМ

В-466 в среде 2, содержащей бутанол в нарастающей концентрации – от

1,2 % об. до 1,85 % об. с шагом 0,05 % об. Селекция проводилась без исполь-

зования физических и химических мутагенных

факторов и

генно-

инженерных методов. В результате адаптивной селекции получен штамм

C. acetobutylicum БИМ В-709 Д, способный выдерживать в 1,3 раза большую

концентрацию бутанола (1,85 % об.) по сравнению с исходным штаммом

(рисунок 1).

8

«Праймтех» (Беларусь). Относительные уровни экспрессии генов groEL и

adhE бактерий C. acetobutylicum БИМ В-466 и C. acetobutylicum БИМ В-709 Д

9

Рисунок 1. – Устойчивость к бутанолу исходного и полученного методом

адаптивной селекции штаммов сольвентогенных бактерий

Примечание – Клетки сольвентогенных бактерий выращивали при 37 °С в среде 2

с бутанолом. Время культивирования 24 ч. Посевной материал с титром 1×109 КОЕ/мл

вносили в количестве 5 % об.

Приобретенный признак толерантности к бутанолу стабильно сохра-

нялся при поддержании штамма C. acetobutylicum БИМ В-709 Д методом

субкультивирования в среде 1 с последующим высевом на агаризованную

среду 2, содержащую 1,85 % об. бутанола в течение 36 месяцев (частота пе-

ресевов – 1 раз в месяц), а также после 10-ти пересевов в отсутствие селекти-

рующего фактора.

Показано, что бутанолтолерантный штамм C. acetobutylicum БИМ

В-709 Д по сравнению с родительским характеризуется на 16,8 % большей

продуцирующей способностью по бутанолу (таблица 1) и в 1,5 раза – макси-

мальной удельной скоростью роста (рисунок 2).

Таблица 1. – Продуцирующая способность (г/л) исходного и адаптированно-

го к бутанолу штаммов клостридий при выращивании в среде 1 (72 ч, 37 °С)

Штамм C. acetobutylicum

Этанол

Ацетон

Бутанол

Сумма растворителей

БИМ В-466

2,00±0,09

4,20±0,44

10,70±0,34

16,90±0,87

БИМ В-709 Д

1,10±0,05

5,10±0,44

12,50±0,37

18,70±0,86

НСР0,5

0,03

0,07

0,06

0,01

10

Рисунок 2. – Показатели роста бактерий C. acetobutylicum БИМ В-466 (1) и

C. acetobutylicum БИМ В-709 Д (2)

Примечание – Клетки сольвентогенных бактерий выращивали при 37 °С в среде 2.

Посевной материал с титром 1×109 КОЕ/мл вносили в количестве 5 % об.

Установлено, что помимо повышенной в 1,3 раза устойчивости к бута-

нолу отселектированный штамм C. acetobutylicum БИМ В-709 Д способен

выдерживать в 3,3 раза большую концентрацию хлорамфеникола (0,1 г/л), в

1,7 раз – хлорида натрия (29 г/л), а также тепловую обработку при 80 ºС в

течение 30 мин по сравнению с родительским штаммом клостридий. Штамм

C. acetobutylicum БИМ В-709 Д депонирован в Белорусской коллекции

непатогенных микроорганизмов по форме «Национальное патентное депони-

рование».

На основании литературных данных сделано предположение, что по-

вышенные бутанолтолерантность и, одновременно, продуктивность бактерий

C. acetobutylicum БИМ В-709 Д могут быть обусловлены изменением состава

липидов клеточных мембран, а также сверхэкспрессией генов белков тепло-

вого шока и образования бутанола (Baer, 1987; Sikkema, 1995; Ezeji, 2010;

Schwarz, 2012; Mann, 2012; Durre, 1995; Lütke-Eversloh, 2011).

Установлено (таблица 2), что содержание насыщенных жирных кислот

(миристиновой,

пальмитиновой,

стеариновой,

метил-9,10-метилен-

октадекановой и 2-гексил-циклопропил-октановой) в составе мембран бута-

нолтолерантного штамма C. acetobutylicum БИМ В-709 Д на 7 % больше, а

11

содержание ненасыщенных жирных кислот (пальмитолеиновой, линолевой и

олеиновой) – на 42 % меньше, чем у родительского штамма C. acetobutylicum

БИМ В-466 (S/U-коэффициент в 1,84 раза выше), что свидетельствует о ста-

билизации клеточной мембраны, уменьшении ее проницаемости и, как след-

ствие, устойчивости бактерий к стрессовым воздействиям.

Таблица 2. – Жирнокислотный состав липидов клеточных мембран

штаммов C. acetobutylicum БИМ В-466 и C. acetobutylicum БИМ В-709 Д

Жирная кислота

Содержание, %

C. acetobutylicum

C. acetobutylicum

БИМ В-466

БИМ В-709 Д

Насыщенные жирные кислоты

Миристиновая С14:0

6,45±1,12

5,13±2,98

Пальмитиновая С16:0

65,57±2,98

75,85±7,60

Стеариновая С18:0

4,40±1,24

4,55±1,14

Насыщенные жирные кислоты, содержащие циклопропановое кольцо

Метил-9,10-метилен-октадекановая C19:0

1,93±0,11

6,28±2,43

2-Гексил-циклопропил-октановая C17:0

7,56±2,73

-

Ненасыщенные жирные кислоты

Пальмитолеиновая С16:1

4,79±1,48

2,73±0,78

Линолевая С18:2

3,00±1,96

1,98±0,38

Олеиновая С18:1

6,30±2,01

3,48±0,98

S/U

6,10

11,21

Примечание – S/U – отношение количества насыщенных жирных кислот к

ненасыщенным.

В исследованиях с использованием метода ПЦР в реальном времени

изучен уровень экспрессии гена белка теплового шока groEL и гена adhE,

кодирующего синтез альдегидалкогольдегидрогеназы, ответственной за об-

разование бутанола, в бактериях исходного и бутанолтолерантного штаммов

клостридий при их выращивании в среде без бутанола и с добавлением

0,9 % об. бутанола. Установлено, что экспрессия гена groEL в клетках

C. acetobutylicum БИМ В-466 при их культивировании в среде с бутанолом

снижалась в 100 раз, а экспрессия гена adhE практически отсутствовала. В то

же время, для адаптированного штамма C. acetobutylicum БИМ В-709 Д в

аналогичных условиях изменений экспрессии исследованных генетических

детерминант не наблюдалось. Полученные данные указывают на то, что в ре-

зультате адаптивной селекции в клетках бактерий C. acetobutylicum

12

БИМ В-709 Д произошли изменения, обеспечившие защиту генов adhE и

groEL от негативного воздействия бутанола в концентрации 0,9 % об.

Таким образом, можно сделать вывод, что стрессоустойчивость и по-

вышенная продуцирующая способность штамма C. acetobutylicum БИМ

В-709 Д не связаны с усилением экспрессии генов groEL и adhE, а обуслов-

лены иными факторами, в частности, стабилизацией клеточных мембран.

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСЕВНОГО

МАТЕРИАЛА C. ACETOBUTYLICUM БИМ В-709 Д

Оптимизированы условия получения вегетативного посевного матери-

ала бактерий C. acetobutylicum БИМ В-709 Д, обеспечивающие высокий титр

жизнеспособных клеток (5±0,5×109 КОЕ/мл): питательная среда 1, количе-

ство последовательных пересевов (пассажей) клеток – 2, продолжительность

культивирования каждого пассажа – 24 ч, норма внесения – 5 % об., темпера-

тура выращивания 37 ºС. При засеве среды 1 полученным инокулятом в ко-

личестве 5 % об. обеспечивается выход бутанола 13,3±0,5 г/л.

С

целью

получения

иммобилизованного

посевного

материала

C. acetobutylicum БИМ В-709 Д проведены исследования по подбору носите-

лей, характеризующихся высокими коэффициентами сорбции, механической

прочностью, устойчивостью к компонентам среды и органическим раствори-

телям, низкой стоимостью (таблица 3).

Таблица 3. – Образование бутанола клетками C. acetobutylicum БИМ

В-709 Д, иммобилизованными на различных носителях

Носитель

Коэффициент сорбции, г/г Выход бутанола, г/л

Нить полиамидная

Полотно полиэфирное

Полиэтилен низкой плотности

Полипропиленовые волокна meltblaun

Прессованная волоконная целлюлоза

Полотно хлопчатобумажное (х/б)

Кремниевые пластины

Керамзит щебнеподобный

Поролон

Уголь древесный

Стекло

Контроль (свободные клетки, 5 % об.)

НСР0,5

0,104±0,009

13,02±0,36

0,022±0,004

13,21±0,44

0,015±0,003

12,05±0,09

0,080±0,007

11,80±0,22

0,088±0,008

13,99±0,44

0,105±0,009

14,88±0,46

0,001±0,0004

2,70±0,01

0,014±0,003

12,54±0,32

0,052±0,007

11,57±0,18

0,093±0,008

15,33±0,13

0,110±0,009

14,42±0,44

-

13,26±0,47

-

0,17

13

Установлено, что наибольшей сорбирующей активностью по отноше-

нию к клеткам C. acetobutylicum БИМ В-709 Д обладают стекло (0,110±

0,009 г/г), х/б полотно (0,105±0,009 г/г), полиамидная нить (0,104±0,009 г/г)

и уголь (0,093±0,008 г/г), а наибольшее увеличение выхода бутанола по срав-

нению с контролем достигается при иммобилизации клеток на угле (16 %),

х/б полотне (12 %) и стекле (9 %). С учетом полученных данных для даль-

нейших исследований отобраны х/б полотно, уголь и стекло.

Изучена динамика образования бутанола клетками C. acetobutylicum

БИМ В-709 Д, иммобилизованными на отобранных носителях, в режиме дли-

тельного отъемно-доливного культивирования с полной заменой питательной

среды каждые 72 ч без дополнительного внесения посевного материала

(рисунок 3).

Рисунок 3. – Продукция бутанола клетками C. acetobutylicum БИМ В-709 Д,

иммобилизованными на х/б полотне, угле и стекле в режиме полной

замены питательной среды каждые 72 ч (среда 1, 30 ºС)

Показано, что максимальный выход бутанола (14,13±0,73 г/л) достига-

ется при использовании иммобилизованного на х/б полотне посевного мате-

риала C. acetobutylicum БИМ В-709 Д, обеспечивающего высокую стабиль-

ность процесса в режиме длительного отъемно-доливного культивирования.

14

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОБУТАНОЛА В

УСЛОВИЯХ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ

Основой повышения конкурентоспособности любой биотехнологии яв-

ляется оптимизация качественного и количественного соотношения элемен-

тов питания с целью получения максимального выхода биомассы или вто-

ричных метаболитов микроорганизмов, а также снижение материальных за-

трат на сырье. Нами предложена частичная замена ржаной муки, традицион-

но применявшейся для ацетонобутилового брожения в количестве 10 % об.

(Логоткин, 1958), отходом спиртового производства ОАО «Бобруйский завод

биотехнологий» – фугатом послеспиртовой зерновой барды, являющимся ис-

точником углеводов (до 1,5 %), азотистых веществ (0,23 %) и других биоген-

ных элементов. Показано, что использование разработанной питательной

среды 3 (ржаная мука - 60 г/л, фугат послеспиртовой зерновой барды - до 1 л)

обеспечивает замену 40 % пищевого сырья на отходы производства и повы-

шение на 70 % выхода бутанола в расчете на потребленный сахар по сравне-

нию с традиционной средой 1.

Помимо стоимости сырья, важнейшим фактором, удорожающим про-

изводство биобутанола, является высокая энергоемкость его выделения из

культуральной среды. В то же время установлено, что увеличение конечной

концентрации бутанола в КЖ с 12 до 19 г/л позволило бы снизить стоимость

его выделения в 2 раза (Phillips 1983, Papoutsakis 2005). В связи с вышеска-

занным и с учетом повышенной бутанолтолерантности C. acetobutylicum

БИМ В-709 Д проведены исследования по увеличению выхода бутанола за

счет использования высококонцентрированных питательных сред. В частно-

сти показано, что использование разработанной питательной среды 4 на ос-

нове

ржаной

муки

(13

%

об.)

обеспечивает

накопление

в

КЖ

C. acetobutylicum БИМ В-709 Д 25,36±2,23 г/л растворителей, в том числе

18,00±0,70 г/л бутанола, что соответственно на 36 и 31 % выше, чем при ис-

пользовании традиционной среды 1.

Оптимизированы условия периодического процесса ацетонобутилового

брожения и показано, что максимальный выход бутанола достигается при

температуре культивирования (31±1) ºС, перемешивании каждые 3 ч в тече-

ние 10 мин, скорости вращения мешалки 30 об./мин и продолжительности

брожения 48 или 72 ч в зависимости от состава используемой среды. По

сравнению с традиционной технологией на среде 3 обеспечивается сокраще-

ние продолжительности процесса на 24 ч, увеличение его производительно-

сти на 39 %, а на среде 4 – увеличение выхода бутанола и производительно-

сти процесса на 42 % (таблица 4).

Условия периодиче-

Общие сахара, г/л

Выход раство-

Выход

ского культивирова-

рителей, г/л

бутанола,

Q,

г/л×ч

0,184±0,01

0,255±0,01

0,261±0,01

исходные

остаточные

85,32±0,31

18,60±0,54

54,00±1,32

9,25±0,44

г/л

19,40±0,85

13,25±0,31

19,88±0,97

12,24±0,48

ния

Традиционная

технология: среда 1,

72 ч, 31±1 °С, без

перемешивания

Оптимизированная

технология: среда 3,

48 ч, 31±1 °С, пере-

мешивание каждые

3 ч по 10 мин

(30 об./мин)

Оптимизированная

технология: среда 4,

72 ч, 31±1°С, пере-

мешивание каждые

3 ч по 10 мин

(30 об./мин)

116,00±1,50 16,00±0,85

33,05±1,10

18,79±0,40

15

Таблица 4. – Показатели эффективности процесса ацетонобутилового

брожения, осуществляемого

штаммом C. acetobutylicum БИМ В-709 Д в

оптимизированных условиях периодического культивирования

НСР0,5

-

0,20

0,12

0,08

0,001

Примечание – Q – производительность процесса по бутанолу с единицы объема

аппарата в единицу времени, г/л×ч.

Для выделения бутанола из КЖ C. acetobutylicum БИМ В-709 Д исполь-

зовали метод прямой отгонки растворителей из среды ацетонобутилового

брожения с последующей ректификацией водно-бутанольной смеси. Показа-

но, что качество получаемого биобутанола (чистота не менее 99 % масс.) со-

ответствует требованиям разработанных технических условий ТУ BY

100289066.114-2014 «БИОБУТАНОЛ».

Достигнутые в результате оптимизации параметров периодического

культивирования штамма C. acetobutylicum БИМ В-709 Д высокая

производительность процесса (0,261±0,10 г/л×ч), а также выход бутанола

(18,79

±

0,40

г/л),

не

уступающий

лучшим

известным

аналогам

C. аcetobutylicum ATCC 824 solRH (pTAAD), США; C. аcetobutylicum ATCC

824 pGROE1, США; C. аcetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk Pthlаdh*,

Южная Корея (Harris, 2001; Papoutsakis [и др.], 2005; Vidhya [и др.], 2010; Lee

16

[и др.], 2012), явились основанием для разработки опытно-промышленной

технологии получения биобутанола.

С этой целью в условиях ОАО «Бобруйский завод биотехнологий» со-

здана опытно-промышленная установка для получения биобутанола, вклю-

чающая ферментационные аппараты объемом 3,2 м3, испаритель бражного

концентрата объемом 0,6 м3, дефлегматор, холодильник-конденсатор, декан-

татор, с использованием которой отработаны технологические параметры

ацетонобутилового брожения и выделения бутанола из культуральной жид-

кости. Производительность процесса по бутанолу в условиях опытно-

промышленного производства составила 0,26 г/л×ч, а себестоимость 1 л био-

бутанола – 58,1 тыс. руб., что сопоставимо со стоимостью н-бутанола, полу-

ченного химическим методом.

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА АЦЕТОНОБУТИЛОВОГО БРОЖЕНИЯ

В УСЛОВИЯХ ОТЪЕМНО-ДОЛИВНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ

Известно, что для ряда биотехнологических процессов использование

отъемно-доливного способа ферментации позволяет существенно увеличить

производительность по целевому продукту, а также снизить расходы сырья,

тепло- и электроэнергии за счет сокращения количества необходимого по-

севного материала, затрат на подготовку и стерилизацию ферментера (Zhao,

2010; Rymowicz, 2010).

Для проведения экспериментов по отъемно-доливному культивирова-

нию штамма C. acetobutylicum БИМ В-709 Д использовали среду 3, количе-

ство заменяемой среды варьировали в интервале 11-40 % об., отъем-долив

осуществляли каждые 4 ч. Культивирование проводили без дополнительного

перемешивания с использованием иммобилизованного на хлопчатобумажном

полотне посевного материала.

Длительность опытов при каждом установившемся режиме, характери-

зовавшемся стабильными показателями концентрации бутанола и остаточ-

ных сахаров в КЖ, составляла 168 ч (таблица 5).

Установлено, что оптимальные условия отъемно-доливного культиви-

рования штамма C. acetobutylicum БИМ В-709 Д достигаются при замене

28 % КЖ на свежую питательную среду каждые 4 ч (коэффициент разбавле-

ния 0,07 ч-1). При этом обеспечивается производительность процесса по бу-

танолу 0,62 г/л×ч, а выход бутанола от потребленного субстрата – 0,14 г/г×ч,

что, соответственно, в 2,4 и 14 раз выше по сравнению с периодическим спо-

собом культивирования.

Сумма

отъема-долива/

Выход бу-

растворителей,

коэффициент раз-

танола, г/л

г/л

бавления, ч-1

Замена 40% КЖ на

Остаточные

Q,

q,

сахара, г/л

г/л×ч

г/г×ч

свежую питательную

3,83±0,46

5,75±0,92

32,54±0,88

среду каждые 4 ч /

0,100

33 %, 4 ч / 0,080

6,08±0,44

9,24±0,92

29,92±0,79

28 %, 4 ч / 0,070

8,93±0,44

13,50±0,92

24,80±0,79

0,37±0,04

0,06±0,002

0,51±0,04

0,07±0,000

0,62±0,03

0,14±0,005

0,50±0,02

0,13±0,003

0,39±0,02

0,12±0,002

0,26±0,01

0,12±0,005

0,26±0,01

0,01±0,000

17

Таблица 5. – Показатели эффективности процесса ацетонобутилового

брожения, осуществляемого

штаммом C. acetobutylicum БИМ В-709 Д в

условиях отъемно-доливного культивирования

Режим

22 %, 4 ч / 0,055

8,97±0,44

17 %, 4 ч / 0,042

9,47±0,44

11 %, 4 ч / 0,028

9,50±0,44

Контроль

(периодический

12,24±0,48

процесс, 48 ч)

13,71±0,88

21,31±0,75

14,70±0,88

19,26±0,75

14,17±0,88

17,90±0,61

19,88±0,97

9,25±0,44

НСР0,5

0,02

0,04

0,15

0,04

0,002

Примечания –

1 – Начальный объем жидкости в аппарате – 0,8 л.

2 – Q – производительность процесса по бутанолу с единицы объема аппарата в

единицу времени, г/л×ч; q – выход бутанола от потребленного субстрата в единицу вре-

мени, г/г×ч.

Таким образом, предложенные подходы, включающие использование

иммобилизованной культуры C. acetobutylicum БИМ В-709 Д в условиях

отъемно-доливной ферментации, способствуют повышению конкурентоспо-

собности технологии получения биобутанола и обеспечивают перспектив-

ность ее реализации в промышленных масштабах.

18

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Отобран из коллекционных культур штамм сольвентогенных бакте-

рий C. acetobutylicum БИМ В-466, характеризующийся наибольшей продуци-

рующей способностью по бутанолу (10,7±0,3 г/л); подобраны условия, обес-

печивающие активный рост штамма (7,5±0,5×109 КОЕ/мл) в питательной

среде на основе ржаной муки [1, 6-9].

Методом адаптивной селекции C. acetobutylicum БИМ В-466 к повы-

шенным концентрациям бутанола получен штамм C. acetobutylicum БИМ

В-709 Д, отличающийся в 1,5 раза более высокой максимальной удельной

скоростью роста (0,52 ч-1); продуцирующей способностью на уровне лучших

известных аналогов (33,05 ± 1,10 г/л растворителей, в т. ч. 18,79 ± 0,40 г/л

бутанола); устойчивостью к бутанолу в концентрации 18,5 г/л, хлориду

натрия – 29 г/л, хлорамфениколу – 0,1 г/л; тепловой обработке при 80 ºС в

течение 30 мин, что в совокупности определяет перспективность его исполь-

зования для производства биобутанола [13, 14].

2. Установлено, что стрессоустойчивость и повышенная продуцирую-

щая способность штамма C. acetobutylicum БИМ В-709 Д не связаны с усиле-

нием экспрессии гена белка теплового шока groEL, а также гена adhE, коди-

рующего синтез альдегидалкогольдегидрогеназы, ответственной за образова-

ние бутанола, а обусловлены иными факторами, в частности, стабилизацией

клеточных мембран вследствие снижения в их составе количества ненасы-

щенных жирных кислот (S/U-коэффициент в 1,84 раза выше, чем у родитель-

ского штамма) [14].

3. Показано, что оптимальные условия получения вегетативного по-

севного материала C. acetobutylicum БИМ В-709 Д, обеспечивающие высокие

титр жизнеспособных клеток (5±0,5×109 КОЕ/мл) и выход бутанола

(13,3±0,5 г/л), достигаются при глубинном выращивании штамма в среде на

основе ржаной муки (10 % об.) в течение 24 ч (2 последовательных пассажа),

температуре 37 ºС, а иммобилизованного – путем 32-часовой сорбции вегета-

тивного инокулята на хлопчатобумажном полотне [2, 5, 10, 11].

4. Разработаны

питательные

среды

для

ацетонобутилового

брожения: 3 – ржаная мука (60 г/л), фугат послеспиртовой барды

(до 1 л), обеспечивающая замену 40 % пищевого сырья на отходы произ-

водства и повышение на 70 % выхода бутанола в расчете на потреблен-

ный сахар по сравнению с традиционной 10 %-й ржаной средой; 4 –

ржаная мука (130 г/л), вода водопроводная (до 1 л), обеспечивающая, по

сравнению с традиционной средой, увеличение выхода бутанола на 31 %

[2, 4, 13, 15].

19

5. Разработана и масштабирована технология получения биобутанола

в периодическом режиме. Показано, что оптимальные условия процесса аце-

тонобутилового брожения достигаются при температуре (31±1) ºС, переме-

шивании каждые 3 ч в течение 10 мин, скорости вращения мешалки

30 об./мин, продолжительности брожения 48 или 72 ч в зависимости от ис-

пользуемой среды. По сравнению с традиционной технологией на среде 3

обеспечивается сокращение продолжительности процесса на 24 ч и увеличе-

ние его производительности на 39 %, а на среде 4 – увеличение выхода бута-

нола и производительности процесса на 42 %, что обеспечивает ценовую

конкурентоспособность биобутанола по сравнению с химическим аналогом

[2, 3, 12, 15].

6. Установлено, что оптимальные условия отъемно-доливного культи-

вирования бактерий C. acetobutylicum БИМ В-709 Д в питательной среде 3

достигаются при коэффициенте разбавления 0,07 ч-1, что обеспечивает суще-

ственное (в 2,4 и 14 раз соответственно) повышение производительности

процесса по бутанолу и выхода бутанола от потребленного субстрата по

сравнению с периодическим способом культивирования [2, 12, 13, 15].

Рекомендации по практическому использованию результатов

К

практическому

использованию

рекомендуются:

штамм

C. acetobutylicum БИМ В-709 Д в качестве продуцента бутанола; технология

получения биобутанола.

Разработана техническая документация: лабораторный ЛР/10-2012

и опытно-промышленный ОПР 700068910.009-2013 регламенты на производ-

ство биобутанола (Приложения Г, Ж), технические условия на биобутанол

ТУ BY 00289066.114-2014 (Приложение Д).

Технология

получения

биобутанола

внедрена

в

производство

ОАО

«Бобруйский

завод

биотехнологий»,

наработаны

опытно-

промышленная

Е, И, Л).

и

установочная

партии

биобутанола

(Приложения

Подана заявка на получение патента на изобретение «Штамм бактерий

Clostridium acetobutylicum для получения бутанола» № а 20131398 от

27.11.2013 (Приложение В).

20

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ СОИСКАТЕЛЯ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Статьи, опубликованные в научных изданиях, включенных в перечень

ВАК Республики Беларусь:

1. Влияние посевного материала и состава питательной среды на

продукцию бутанола

Clostridium acetobutylicum

/ Е. В. Болотник,

Э. И. Коломиец, М. И. Дорина, И. Н. Ананьева, Л. Т. Мишин. // Вес. НАН

Беларусі. Сер. біял. навук. – 2011. – № 3. – С. 62–66.

2. Болотник, Е. В. Ацетонобутиловое брожение как основа получения

нового вида топлива из возобновляемого сырья / Е. В. Болотник,

Н. Е. Литвинович, Э. И. Коломиец // Микробные биотехнологии:

фундаментальные и прикладные аспекты : сб. науч. тр. / Нац. акад. наук

Беларуси, Ин-т микробиологии, Белорус. обществ. об-ние микробиологов;

под ред. Э. И. Коломиец (отв. ред.) [и др.]. – Минск, 2013. – Т. 5. – С. 411–430.

3.

Экстракционное

извлечение

н-бутанола

и

сопутствующих

растворителей из среды ацетонобутилового брожения / Ю. В. Григорьев,

О. А. Ивашкевич, С. М. Лещев, И. М. Григорьева, Е. В. Болотник // Вест.

Белорус. гос. ун-та. Сер. 2, Химия. Биология. География. – 2013. – № 1. –

С. 29–32.

4. Использование послеспиртовой зерновой барды для получения

биобутанола / Е. В. Болотник, Н. Е. Литвинович, Г. В. Жук, Л. Т. Мишин,

Д. А. Пручковский, Э. И. Коломиец // Вес. НАН Беларусі. Сер. біял. навук. –

2013. – № 4. – С. 77–81.

5. Болотник, Е. В. Оптимизация условий получения и внесения

посевного материала бактерий – продуцентов бутанола / Е. В. Болотник //

Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты : сб.

науч. тр. / Нац. акад. наук Беларуси, Ин-т микробиологии, Белорус. обществ.

об-ние микробиологов; под ред. Э. И. Коломиец (отв. ред.) [и др.]. – Минск,

2014. – Т. 6. – С. 240–253.

Материалы конференций:

6. Болотник, Е. В. Оптимизированная технология ацетонобутилового

брожения как основа получения топливного биобутанола из возобновляемого

сырья / Е. В. Болотник // Молодежный инновационный форум «ИНТРИ» -

2010 : материалы секц. заседаний, Минск, 29-30 нояб. 2010 г. / Гос. ком. по

21

науке и технологиям Респ. Беларусь, Белорус. ин-т систем. Анализа и

информ. обеспечения науч.-техн. сферы ; под общ. ред. И. В. Войтова. –

Минск, 2010. – С. 140-141.

Тезисы докладов:

7. Антюшеня (Болотник), Е. В. Новые подходы к получению

биобутанола на основе возобновляемого сырья / Е. В. Антюшеня,

Л. Т. Мишин, Г. В. Новик, Э. И. Коломиец / материалы XII съезда

товарищества микробиологов Украины им. С. М. Виноградского, Ужгород,

25-30 мая 2009 г. / НАН Украины, Ужгор. нац. ун-т ; редкол.: Л. В. Авдеева

[и др.]. – Ужгород, 2009. – C. 356.

8. Антюшеня (Болотник), Е. В. Получение активных стартовых куль-

тур Clostridium acetobutylicum / Е. В. Антюшеня, Э. И. Коломиец,

И. Н. Ананьева, Л. Т. Мишин, М. И. Дорина / Актуальные проблемы микро-

биологии и биотехнологии : материалы Междунар. науч. конф., Респ. Молдо-

ва, 5–6 нояб. 2009 г. / Акад. наук Молдавии, Ин-т микробиологии и биотех-

нологии, Молд. о-во микробиолов ; редкол.: Г. Дука [и др.]. – Кишинев,

2009. – С. 147–148.

9.

Антюшеня

(Болотник),

Е. В.

Сольвентогенная

активность

Clostridium acetobutylicum на питательных средах с различными источниками

углерода / Е. В. Антюшеня, Э. И. Коломиец, И. Н. Ананьева, Л. Т. Мишин,

М. И. Дорина // Биология – наука XXI века : материалы 13-й Междунар.

Пущинской шк.-конф. молодых учен., Пущино, 28 сент. – 2 окт. 2009 г. / Рос.

акад. наук [и др.]. ; редкол.: А.И. Мирошников [и др.]. – Пущино, 2009. –

С. 157.

10.

Антюшеня

(Болотник),

Е. В.

Получение

биобутанола

из

возобновляемого сырья: современное состояние разработок в Республике

Беларусь / Э. И. Коломиец, О. А. Ивашкевич, Е. В. Антюшеня (Болотник),

Г. И. Новик, И. Н. Ананьева / Биотехнология: экология крупных городов :

материалы Моск. Междунар. науч.-практ. конф., Москва, 15-17 марта, 2010 г.

/ ЗАО «Эспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. – М., 2010. –

С. 303–304.

11. Bolotnik, E. V. Application of food industry wastes to produce

ecologically safe biofuel / E. V. Bolotnik, E. I. Kolomiec, G. I. Novik.,

I. N. Ananeva // PhD course and minisymposium «Adaptation to climate change in

the Baltic sea region: contributions from plant and microbial biotechnology», July

12-17, 2010, Mikkeli, Finland / ed.: J. P. T. Valkonen [et al.] ; Dep. of Agricultural

Sciences, Univ. of Helsinki. – Helsinki, 2010. – Р. 38.

22

12. Болотник, Е. В. Оптимизация технологических параметров

ацетонобутилового брожения с целью получения топливного биобутанола /

Е. В. Болотник // Молодь у вирішенні екологічних та соціально-економічних

проблем сьогодення : зб. матеріалів конф., Каменец-Подольский, 15–20

жовтня, 2012 г. / Ін-т агроекології і природокористування НААН,

Подільських держ. аграрно-технічний ун-т ; навук. рада: В.Ф. Петриченко

[і інш.]. – Київ, 2012. – С. 116–117.

13. Болотник, Е. В. Подходы к повышению конкурентоспособности

технологии

получения

топливного

биобутанола

/

Е.

В.

Болотник,

Н. Е. Литвинович, Э. И. Коломиец, Ю. В. Григорьев, Ю. А. Рыбаков,

Г. П. Лукина // Биотехнология: состояние и перспективы развития :

материалы VII Моск. Междунар. конг., Москва, 19- 22 марта 2013 г. : в 3 т. /

ЗАО «Эспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. – М., 2013. –

Т. 2. – С. 121–122.

14.

Болотник,

Е.

В.

Изучение

факторов,

обуславливающих

стрессоустойчивость

штамма

сольвентогенных

бактерий

Clostridium

acetobutylicum, полученного методом адаптивной селекции / Е. В. Болотник,

Н. Е. Литвинович, Т. Е. Кирпичѐва, Э. И. Коломиец, М. А. Титок //

Биотехнология и качество жизни : материалы Междунар. науч.-практ. конф.,

Москва, 18-20 марта 2014 г. / ЗАО «Эспо-биохим-технологии», РХТУ им.

Д.И. Менделеева. – М., 2014. – С. 478–479.

15. Болотник, Е. В. Оптимизация условий ацетонобутилового броже-

ния / Е.В. Болотник // Молодежь в науке – 2014 : материалы XI Междунар.

науч. конф., Минск, 18-21 ноября 2014 г. / НАН Беларуси [и др.]. – Минск,

2014. – С. 93.

23

РЭЗЮМЭ

БАЛОТНІК Алена Валер’еўна

АСНОВЫ ТЭХНАЛОГІІ АТРЫМАННЯ БІЯБУТАНОЛУ З

ВЫКАРЫСТАННЕМ АДСЕЛЕКТАВАНАГА ШТАМА CLOSTRIDIUM

ACETOBUTYLICUM БIМ В-709 Д

Ключавыя словы: біябутанол, Clostridium acetobutylicum, адаптыўная

селекцыя

ацэтонабуцілавае

закісанне,

імабілізацыя,

перыядычнае

культываванне, ад’ѐмна-даліўное культываванне.

Мэта работы: атрыманне высокаактыўнага штама-прадуцэнта і

распрацоўка на яго аснове тэхналогіі атрымання біябутанолу.

Метады

даследавання

i

скарыстаная

апаратура:

светлавая

мікраскапія, ПЛР у рэжыме рэальнага часу, газавая храматаграфія, храмата-

мас-спектраметрыя,

імабілізацыя

клетак,

глыбіннае

культываванне;

мікраскоп Kozo Optics XJS 500, ампліфікатар

Stratagene Mx3000P,

храматограф Хром-5, храматограф Agilent Technologies 6890N з мас-

селектыўным дэтэктарам 5975 Inert.

Атрыманыя вынікі і іх навізна. Метадам адаптыўнай селекцыі

атрыманы штам C. acetobutylicum БІМ В-709 Д – новы прадуцэнт бутанолу,

які не саступае лепшым замежным аналагам. Упершыню паказана, што

папярэдняя адаптацыя C. acetobutylicum БІМ В-709 Д да бутанолу спрыяе

стабілізацыі клеткавых мембран і падвышэнню ўстойлівасці культуры да

хларамфеніколу,

тэмпературнаму

і

асматычнаму

стрэс-фактарам.

Распрацавана тэхналогія атрымання біябутанолу ў перыядычным і ад’ѐмна-

даліўном рэжымах, якая забяспечвае коштавую канкурэнтаздольнасць

біябутанолу ў параўнанні з хімічным аналагам. Паказана, што выкарыстанне

імабілізаванай культуры C. acetobutylicum БІМ В-709 Д ва ўмовах ад’ѐмна-

даліўной ферментацыі (хуткасць развядзення 0,07 г-1) дазваляе павялічыць

выйсце бутанолу ад спажытага субстрата ў 14 раз і прадукцыйнасць

ацэтонабуцілавага закісання ў 2,4 раза ў параўнанні з перыядычным

працэсам,

што

вызначае

перспектыўнасць

рэалізацыі

распрацаванай

тэхналогіі ў прамысловых маштабах.

Рэкамендацыі па выкарыстаннi: штам C. acetobutylicum БІМ В-709 Д –

прадуцэнт бутанолу і распрацаваная на яго аснове тэхналогія атрымання

біябутанолу.

Вобласць

ужывання:

мікрабіялогія,

біятэхналогія,

хімічная

прамысловасць, энергетыка.

24

РЕЗЮМЕ

БОЛОТНИК Елена Валерьевна

ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОБУТАНОЛА

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОТСЕЛЕКТИРОВАННОГО ШТАММА

CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM БИМ В-709 Д

Ключевые слова: биобутанол, Clostridium acetobutylicum, адаптивная

селекция, ацетонобутиловое брожение, иммобилизация, периодическое куль-

тивирование, отъемно-доливное культивирование.

Цель работы: получение высокоактивного штамма-продуцента и раз-

работка на его основе технологии получения биобутанола.

Методы исследования и использованная аппаратура: световая мик-

роскопия, ПЦР в режиме реального времени, газовая хроматография, хрома-

то-масс-спектрометрия, иммобилизация клеток, глубинное культивирование;

микроскоп Kozo Optics XJS 500, амплификатор Stratagene MX3000P, хрома-

тограф Хром-5, хроматограф Agilent Technologies 6890N с масс-селективным

детектором 5975 Inert.

Полученные результаты и их новизна. Методом адаптивной селек-

ции получен штамм C. acetobutylicum БИМ В-709 Д – новый продуцент бута-

нола, не уступающий лучшим известным аналогам. Впервые показано, что

предварительная адаптация C. acetobutylicum БИМ В-709 Д к бутанолу спо-

собствует стабилизации клеточных мембран и повышению устойчивости

культуры к хлорамфениколу, температурному и осмотическому стресс-

факторам. Разработана технология получения биобутанола в периодическом

и отъемно-доливном режимах, обеспечивающая ценовую конкурентоспособ-

ность биобутанола по сравнению с химическим аналогом. Показано, что ис-

пользование иммобилизованной культуры C. acetobutylicum БИМ В-709 Д в

условиях отъемно-доливной ферментации (скорость разбавления 0,07 ч-1)

позволяет увеличить выход бутанола от потребленного субстрата в 14 раз и

производительность ацетонобутилового брожения в 2,4 раза по сравнению с

периодическим процессом, что определяет перспективность реализации раз-

работанной технологии в промышленных масштабах.

Рекомендации по использованию: штамм C. acetobutylicum БИМ

В-709 Д – продуцент бутанола и разработанная на его основе технология по-

лучения биобутанола.

Область применения: микробиология, биотехнология, химическая

промышленность, энергетика.

acetone-butyl

fermentation.

fermentation, immobilization, batch culture, semi-continuous

Aim of investigation: selection of highly active bacterial strain and

development of biobutanol production technology.

Methods of investigation and applied equipment: light microscopy,

real-time PCR, gas chromatography, chromato-mass spectrometry, microbial cell

immobilization, submerged cultivation; microscope Kozo Optics XJS 500,

thermocycler Stratagene MX3000P, chromatograph Chrome 5, chromatograph

Agilent Technologies 6890N with a mass selective detector 5975 Inert.

Obtained results and their novelty. The strain C. acetobutylicum BIM

B-709 D - new producer of butanol on a par with best foreign analogues was

obtained by adaptive selection method. It was shown that preliminary adaptation of

C. acetobutylicum BIM B-709 D to butanol promoted stabilization of cell

membranes and increased resistance of the culture to chloramphenicol, temperature

and osmotic stress factors. Technology of producing biobutanol in batch and

semi-continuous mode was developed and cost of the product competed well with

chemical

analogue.

It

was

demonstrated

that

immobilized

strain

C. acetobutylicum BIM B-709 D during semi-continuous process (dilution rate

0.07 h-1) raised 14-fold butanol yield from the consumed substrate and increased

2.4 times productivity of acetone-butyl fermentation as compared to batch culture,

indicating attractive commercial prospects of this technology.

Recommendations for use: strain C. acetobutylicum BIM B-709 D –

butanol producer and the derived biotechnology.

Application areas: microbiology, biotechnology, chemical industry,

energetics.

25

SUMMARY

BALOTNIK Alena Valeryevna

THE PRINCIPLES OF BIOBUTANOL PRODUCTION TECHNOLOGY

USING SELECTED STRAIN CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM

BIM B-709 D

Key words: biobutanol, Clostridium acetobutylicum, adaptive selection,

26

Подписано в печать 21.05.2015 Формат 60х841/16 Бумага офсетная

Гарнитура Roman Печать цифровая Усл.печ.л. 1,4 Уч.изд.л. 1,5

Тираж 60 экз. Заказ № 2020

ИООО «Право и экономика» 220072 Минск Сурганова 1, корп. 2

Тел. 284 18 66, 8 029 684 18 66

E-mail: pravo-v@tut.by; pravo642@gmail.com Отпечатано на издательской системе

KОNICA MINOLTA в ИООО «Право и экономика»

Свидетельство о государственной регистрации издателя,

изготовителя, распространителя печатных изданий, выданное

Министерством информации Республики Беларусь 17 февраля 2014 г.

в качестве издателя печатных изданий за № 1/185



 
Похожие работы:

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР ТРАНСФУЗИОЛОГИИ И МЕДИЦИНСКИХ БИОТЕХНОЛОГИЙ УДК 616.155.392-021.3-07-036 КЛИМКОВИЧ Наталья Николаевна ПЕРВИЧНЫЕ МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ: МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, ДИАГНОСТИКА, КРИТЕРИИ ПРОГНОЗА Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.01.21 – гематология и переливание крови Минск 2015 Работа выполнена в...»

«Хазиахматова Ольга Геннадьевна РОЛЬ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ В ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ Т-ЛИМФОЦИТОВ: МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТЫ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2015 1 доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии ФГБОУ Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической...»

«Керея Анна Викторовна ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОСЕКУНДНЫХ ИМПУЛЬСНЫХ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ИЗЛУЧЕНИЙ НА ГОЛОВНОЙ МОЗГ И ЭПИДИДИМАЛЬНУЮ ЖИРОВУЮ ТКАНЬ МЫШЕЙ Специальность 03.03.01 – Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2015 доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической психонейроиммунологии и нейробиологии ФГБНУ...»





 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.