авторефераты диссертаций www.z-pdf.ru
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
 

На правах рукописи

МИКЕРОВ Анатолий Николаевич

КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА УРОВЕНЬ

ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ

В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва – 2016

2

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении

высшего профессионального образования «Саратовский государственный меди-

цинский университет им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения

Российской Федерации (ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского»

Минздрава России)

Научный консультант:

Елисеев Юрий Юрьевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий ка-

федрой общей гигиены и экологии ГБОУ ВПО «Саратовский государственный

медицинский университет им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохране-

ния Российской Федерации

Официальные оппоненты:

Калюжин Олег Витальевич - доктор медицинских наук, профессор, профессор

кафедры клинической иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО «Первый Мос-

ковский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Мини-

стерства здравоохранения Российской Федерации

Ненашева Наталья Михайловна - доктор медицинских наук, профессор, профес-

сор кафедры клинической аллергологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская

академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Россий-

ской Федерации

Воропаева Елена Александровна - доктор биологических наук, руководитель ла-

боратории клинической микробиологии и биотехнологии ФБУН «Московский

научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.

Габричевского» Роспотребнадзора

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министер-

ства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «__» __________ 2016 года в ____ часов на заседании диссерта-

ционного совета Д 208.130.01 в Федеральном государственном бюджетном учре-

ждении «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микро-

биологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохра-

нения Российской Федерации по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д.18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф.

Гамалеи» Минздрава РФ и на сайте Центра: http://gamaleya.org

Автореферат диссертации разослан «___» ____________ 2016 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор

Русакова Екатерина Владимировна

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности

Болезни органов дыхания остаются одной из самых актуальных проблем со-

временного здравоохранения во всём мире. В структуре лёгочных заболеваний

одну из лидирующих позиций занимают пневмонии. Согласно статистическим

данным Министерства здравоохранения, в России в 2012 году было зарегистриро-

вано 658 тысяч больных пневмонией, включая 201 тысячу детей в возрасте до 14

лет (http://www.rosminzdrav.ru/documents/8029-statisticheskaya-informatsiya-2012).

Нозокомиальная пневмония является одним из наиболее часто встречаю-

щихся в стационаре инфекционных заболеваний, и имеет особое значение для

больных, находящихся на искусственной вентиляции лёгких (Чучалин А.Г., 2009).

Внебольничная пневмония относится к числу наиболее распространённых острых

инфекционных заболеваний вне стационара и является одной из ведущих причин

смертности от инфекционных болезней (Чучалин А.Г., 2010). Высокая значимость

и распространённость пневмонии обусловливает необходимость комплексной

оценки факторов, участвующих в модулировании иммунной защиты в лёгких и,

следовательно, вносящих вклад в заболеваемость и смертность населения.

На ранних этапах развития инфекционного процесса в лёгких наибольшее

значение для защиты от патогенных микроорганизмов имеют механизмы врож-

дённого иммунитета, среди которых важнейшую роль играет фагоцитоз. При

этом, «растворимые рецепторы для патогенов», являющиеся факторами врождён-

ного иммунитета, связывают микробные продукты в жидких средах организма и

обеспечивают возможность их последующего поглощения фагоцитами (Хаитов

Р.М., 2013). Таким фактором врождённого иммунитета в составе лёгочного сур-

фактанта, выстилающего поверхность альвеолярного эпителия и, поэтому, пер-

вым контактирующего с патогенами, содержащимися во вдыхаемом воздухе, яв-

ляется сурфактантый белок А (Surfactant Protein A, SP-A). Показано, что белок SP-

A повышает опсонизацию и агрегацию микроорганизмов, стимулирует активацию

комплемента, повышает хемотаксис макрофагов и фагоцитоз, регулирует воспа-

лительный ответ путём влияния на пролиферацию клеток иммунного ответа и на

4

продукцию цитокинов, повышает продукцию реактивных оксидантов, опосредует

механизмы аллергических реакций в лёгких и координирует врождённый и при-

обретённый иммунитет (Chroneos, 2010; Nayak, 2012; Ariki, 2012). Поэтому любые

модификации в молекуле белка SP-A вследствие воздействия различных факторов

(например, окислительного стресса) могут повлиять сразу на множество процес-

сов, опосредуемых этим иммуномодуляторным белком в ходе иммунного ответа

при пневмонии.

SP-A человека состоит из двух генных продуктов - SP-A1 и SP-A2, отлича-

ющихся по аминокислотному составу и функциональной активности. При этом,

соотношение SP-A1 и SP-A2 в лёгких отличается у разных индивидуумов

(Silveyra, 2013), что может потенциально отражаться на уровне иммунной защиты

при пневмонии. Хотя известно, что одной из наиболее важных функций белка SP-

A в лёгких является стимулирование фагоцитоза микроорганизмов альвеолярны-

ми макрофагами, до сих пор оставался открытым вопрос относительно различий в

профагоцитарной активности между SP-A1 и SP-A2.

Помимо микроорганизмов, лёгкие человека находятся в постоянном контак-

те с опасными химическими компонентами воздушной среды. Повышенный уро-

вень антропогенного загрязнения воздуха в крупных городах может отражаться

на антиинфекционной резистентности лёгких (Silveyra, 2012). Одним из ключе-

вых компонентов городского смога является тропосферный озон, вторичный фо-

тохимический загрязнитель и активный оксидант. В последние годы во всём мире

ему уделяется много внимания в связи с его значительным воздействием на здо-

ровье населения (Yang, 2009). Учитывая выраженные иммуномодулирующие

свойства SP-A, изменение функциональной активности SP-A и SP-A вариантов

вследствие воздействия окислителями воздуха, может приводить к неадекватной

работе механизмов иммунной защиты в лёгких при пневмонии.

Развитие пневмонии, как и ряда других лёгочных заболеваний человека, за-

висит от влияния гендера. Известно, что в большинстве случаев мужчины более

подвержены заболеванию пневмонией, чем женщины, и имеют менее благопри-

ятный прогноз течения заболевания (Baine, 2001; Gannon, 2004). Однако, уровень

5

иммунной защиты у представителей разного пола при пневмонии в условиях за-

грязнения воздушной среды оксидантами до сих пор комплексно не исследовался.

Использование экспериментальных животных в данном случае позволяет ком-

плексно изучить влияние воздействия поллютантов воздуха, в частности озона, на

уровень иммунной защиты у представителей разного пола при пневмонии.

Таким образом, благоприятные течение и исход пневмонии во многом зави-

сят от эффективности работы механизмов врождённого иммунитета в лёгких, ко-

торые, в свою очередь, могут находиться под влиянием других факторов, таких

как степень загрязнения воздушной среды оксидантами, в частности озоном, и

гендерной принадлежности, что подчёркивает актуальность комплексного подхо-

да к оценке факторов, влияющих на уровень иммунной защиты при пневмонии.

Цель исследования

Комплексная оценка факторов, оказывающих влияние на уровень иммунной

защиты при пневмонии в эксперименте в условиях окислительного стресса, вы-

званного воздействием озона.

Задачи исследования

1. Сравнить иммуномодулирующую активность препаратов белков SP-A1

и SP-A2 человека по их способности стимулировать фагоцитоз бактерий альвео-

лярными макрофагами и выявить механизм потенциальных различий в профаго-

цитарной активности между SP-A1 и SP-A2.

2. Изучить влияние окислительной модификации на профагоцитарную ак-

тивность SP-A и его SP-A1 и SP-A2 вариантов.

3. Получить антитела к SP-A1 и оценить относительное содержание вари-

антов SP-A в лёгких различных индивидуумов.

4. Исследовать иммуномодулирующее влияние белка SP-A на уровень ан-

тиинфекционной резистентности у самок и самцов мышей при эксперименталь-

ной пневмонии после ингаляции озона.

5. Изучить влияние озона на уровень иммунной защиты у лабораторных

мышей при экспериментальной пневмонии по показателю их выживаемости по-

сле инфицирования, вызванного бактериями K. pneumoniae.

6

6. Оценить половые различия у лабораторных мышей в уровне иммунной

защиты при экспериментальной пневмонии в условиях окислительного стресса,

вызванного ингаляцией озона, и провести комплексный анализ механизмов, ле-

жащих в основе данных различий.

7. На основании полученных экспериментальных данных охарактеризовать

общие и гендерспецифические факторы, влияющие на уровень иммунной защиты

при пневмонии в условиях индуцированного озоном окислительного стресса.

Научная новизна

Впервые проведён анализ профагоцитарной активности вариантов SP-A1 и

SP-A2 человека. Показано, что рекомбинантный SP-A2 стимулирует фагоцитоз

бактерий альвеолярными макрофагами in vitro в большей степени, чем SP-A1.

Выявлено, что механизм данных различий связан с аминокислотным остатком в

позиции 85, где SP-A1 имеет цистеин, а SP-A2 – аргинин.

В условиях in vitro впервые выявлено, что профагоцитарная активность

SP-A человека снижается с повышением степени его окисления озоном, и SP-A2

более подвержен негативному эффекту озона, чем SP-A1.

Впервые получены антитела к SP-A1, которые могут быть использованы для

определения геноспецифического состава SP-A в лёгких человека.

Впервые комплексно исследовано влияние белка SP-A, фактора врождённо-

го иммунитета, на восприимчивость мышей к пневмонии в условиях оксидантной

нагрузки. Показано, что SP-A вовлечён в модулирование иммунной защиты при

пневмонии в эксперименте.

Создана модель пневмонии, которая впервые позволила исследовать состо-

яние иммунитета у лабораторных животных при одновременном воздействии

окислительного стресса вследствие ингаляции озона, половой принадлежности и

наличия SP-A. До настоящего времени вопрос относительно влияния гендера на

иммунную защиту при пневмонии в условиях оксидантной нагрузки оставался

открытым. Установлено, что в отсутствие окислительного стресса самцы мышей

более восприимчивы к пневмонии, чем самки, тогда как ингаляция озона меняла

этот тренд на противоположный – уровень иммунной защиты при пневмонии был

7

ниже у самок по сравнению с самцами. Кроме того, уровень окисления SP-A в

условиях окислительного стресса был выше у самок, чем у самцов.

На основании комплексного исследования в экспериментах in vitro и in vivo

выявлены общие и гендерспецифические факторы, влияющие на уровень иммун-

ной защиты при пневмонии в условиях отсутствия или наличия окислительного

стресса, вызванного воздействием озона.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты позволяют идентифицировать группы риска при

пневмонии. Показано, что эффективность работы врождённого иммунитета в лёг-

ких может зависеть от геноспецифического состава SP-A. Выявленные in vitro

маркеры эффективности иммунного ответа в лёгких позволяют прогнозировать

тяжесть течения лёгочной инфекции у людей в зависимости от соотношения SP-

A1 и SP-A2 в лёгких. Полученные данные позволяют предполагать, что пациенты,

имеющие больше SP-A1, чем SP-A2 в лёгких, могут быть менее защищены от

пневмонии и, следовательно, могут нуждаться в более интенсивной терапии, в

том числе, путём введения экзогенного белка SP-A.

Проведённое исследование имеет существенное значение в понимании роли

SP-A в модулировании иммунной защиты при пневмонии в условиях оксидантной

нагрузки. Выявлено, что профагоцитарная активность белка SP-A снижается по-

сле его обработки озоном. При этом профагоцитарная активность SP-A2 снижает-

ся в большей степени, чем SP-A1. Результаты данной работы позволяют предпо-

лагать, что снижение функциональной активности SP-A (особенно SP-A2) путём

окислительных модификаций может приводить к недостаточно эффективной ра-

боте врождённого компонента иммунитета в лёгких, что, в свою очередь, может

вносить значительный вклад в повышение риска развития пневмонии в случае по-

вышенного загрязнения тропосферного воздуха озоном и другими оксидантами.

Полученные антитела, специфичные к SP-A1, могут быть полезны при ком-

плексной терапии пациентов путём возможного введения экзогенного белка SP-A,

поскольку позволяют определять геноспецифический состав SP-A в лёгких чело-

века, и, соответственно, уровень иммунной защиты при пневмонии.

8

В результате экспериментального исследования создан научный фундамент

для обоснования необходимости комплексного подхода к оценке иммунитета при

пневмонии у человека с учётом гендерной принадлежности, окислительного

стресса и геноспецифического состава SP-A.

Выявленные половые различия в уровне иммунной защиты у самцов и са-

мок мышей при пневмонии в эксперименте в зависимости от наличия окисли-

тельного стресса, имеют существенное значение в понимании проблемы взаимо-

действия гендера и факторов загрязнения воздушной среды с компонентами

врождённого иммунитета при пневмонии у человека. Результаты исследования на

экспериментальных животных позволяют предполагать, что антропогенное за-

грязнение городов, в частности тропосферным озоном, может оказывать значи-

тельно больший негативный эффект на иммунный статус лёгких пациентов жен-

ского пола, чем мужского, что указывает на необходимость дифференцированно-

го подхода к больным пневмонией пациентам мужского и женского полов при

проведении профилактических мероприятий и лечения. Кроме того, полученные

данные свидетельствуют о необходимости осуществления независимой оценки

влияния поллютантов на состояние антиинфекционной защиты у особей разного

пола в экспериментальных моделях.

Данные экспериментальных исследований используются в учебном процес-

се кафедры клинической иммунологии и аллергологии, кафедры микробиологии,

вирусологии и иммунологии, и кафедры общей гигиены и экологии Саратовского

государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского, а также

используются в научной работе сотрудников клиники профпатологии и гематоло-

гии г. Саратова, о чём имеются соответствующие акты внедрения.

Методология и методы исследования

Методология исследования спланирована в соответствии с современными

принципами научного познания и поставленной целью. Предметом исследования

являлось изучение факторов, влияющих на уровень иммунной защиты при пнев-

монии в эксперименте в условиях окислительного стресса. Планирование и про-

ведение исследований, направленных на реализацию поставленных задач, осу-

9

ществлялось на основе комплекса современных общенаучных и специфических

методов и подходов: иммунологических, микробиологических, гистологических,

биохимических, молекулярно-генетических, биоинформационных и статистиче-

ских. Они включали оценку профагоцитарной активности иммуномодуляторного

белка SP-A и его SP-A1 и SP-A2 вариантов in vitro; анализ механизмов различной

профагоцитарной активности SP-A вариантов; оценку влияния SP-A на протеом

бронхоальвеолярного лаважа; получение антител, специфичных к SP-A1 и их ха-

рактеристика; анализ результатов экспериментальной пневмонии в условиях

окислительного стресса с целью оценки иммунитета; интегральный метод оценки

состояния иммунитета; оценку уровня врождённого иммунитета по фагоцитарной

реакции in vivo; оценку микробиологического показателя иммунорезистентности;

оценку гистологических изменений; оценку влияния различных факторов на уро-

вень иммунной защиты. При выполнении работы использовали отечественные и

международные научные базы данных и информационные ресурсы, такие как

PubMed и e-library, материалы российских и зарубежных научных журналов, рос-

сийских и международных научных конференций. Анализ полученных результа-

тов проводили с использованием общепринятых статистических методов анализа.

Личный вклад соискателя

Диссертационная работа выполнена лично автором, а также в сотрудниче-

стве

с

коллегами

из

Пенсильванского

государственного

медицинского

университета (г. Херши, США) - профессорами Дж. Флорос, Д.С. Фелпс и со-

трудниками их лабораторий, научными сотрудниками Т.K. Купер и Н. Томас;

профессором Медицинского университета г. Бостона (США) K. Хартшорн и

профессором Столичного института педиатрии (Пекин, КНР) К. Ган. Личное уча-

стие соискателя в получении результатов, изложенных в диссертации, заключа-

лось в анализе данных научной литературы, разработке научной проблемы и ди-

зайна экспериментов, выполнении большей части экспериментальной работы,

анализе полученных данных и их статистической обработке, а также в написании

научных статей. Автореферат и диссертация автором написаны лично.

10

Положения, выносимые на защиту

1. SP-A1

и

SP-A2

варианты

в

различной

степени

вовлечены

в

модулирование механизмов врождённого иммунитета: SP-A2 более эффективно

стимулирует фагоцитоз бактерий альвеолярными макрофагами по сравнению с

SP-A1. За данные геноспецифические различия отвечает аминокислотный остаток

в позиции 85 белка SP-A.

2. Обработка озоном снижает профагоцитарную активность белка SP-A

человека и его SP-A1 и SP-A2 вариантов; SP-A2 более подвержен негативному

влиянию озона, чем SP-A1.

3. Белок SP-A, фактор врождённого иммунитета, играет ключевую роль в

иммунной защите при экспериментальной пневмонии в условиях оксидантной

нагрузки вследствие ингаляции озона.

4. Эффективность иммунной защиты при экспериментальной пневмонии

зависит от наличия окислительного стресса. Ингаляция озона приводит к

неблагоприятному развитию пневмонии у экспериментальных животных обоих

полов.

5. У экспериментальных животных разного пола, факторы, которые вносят

вклад в эффективность антибактериальной защиты при пневмонии в отсутствие

или при наличии оксидантной нагрузки вследствие ингаляции озона, различают-

ся.

6. Предложенная на основе полученных данных экспериментальная модель

описывает общие и гендерспецифические факторы, влияющие на уровень

иммунной защиты при пневмонии, в условиях отсутствия или наличия

окислительного стресса, вызванного воздействием озона.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Для решения поставленных задач был проведён большой объём работы с

использованием современных in vitro и in vivo методов исследования, а также зна-

чительного количества лабораторных животных. Все эксперименты имели не ме-

нее, чем трёхкратную повторность. Анализ полученных результатов проводили с

использованием общепринятых статистических методов, а обсуждение результа-

11

тов исследования проведено с учётом современных научных данных. Положения,

выносимые на защиту, выводы и рекомендации по использованию научных выво-

дов подтверждены фактическим материалом и отражают основные достижения

соискателя по теме исследования.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на American

Thoracic Society International Conference (Сиэтл, Вашингтон, США, 2003; Сан-

Диего, Калифорния, США, 2005; Сан-Диего, Калифорния, США, 2009; Новый

Орлеан, Луизиана, США, 2010; Денвер, Колорадо, США, 2011), 17th Annual North

American Cystic Fibrosis Conference (Анахайм, Калифорния, США, 2003), Pediatric

Research Day Penn State Children’s Hospital Conference (Херши, Пенсильвания,

США, 2004; 2006; 2008), FASEB Summer Research Conferences. «Lung surfactant:

cellular and molecular biology» (Сакстонс Ривер, Вермонт, США, 2004), Experi-

mental Biology Meeting (Вашингтон, США, 2007), 47th American Society for Cell Bi-

ology Annual Meeting (Вашингтон, США, 2007), Всероссийской конференции

«Социальные проблемы медицины и экологии человека» (Саратов, 2009), а также

представлены на XIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека»

(Самара, 2008), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург,

2009), X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, им-

мунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).

Апробация диссертационной работы состоялась на заседании проблемной

комиссии по гуманитарным и социально-значимым проблемам медицины Сара-

товского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского

(протокол № 6 от 19 ноября 2015 г).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 35 научных работах, в том числе в

16 статьях, опубликованных в журналах, включенных в перечень рецензируемых

и рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов

диссертаций на соискание учёной степени доктора и кандидата наук (из них 14

статей

опубликованы

в изданиях, включенных

в международные

базы

цитирования - Web of Science и Scopus). Материалы диссертации включены в мо-

12

нографию - А.Н. Микеров, Ю.Ю. Елисеев «Сурфактантный белок А (SP-A): роль

в иммунной защите лёгких и факторы, влияющие на его функцию. Саратов: Изд-

во Саратовского медицинского университета им. В.И. Разумовского, 2013.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа изложена на 200 страницах, содержит 8 таблиц и

51 рисунок. Она состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных ис-

следований, включая главу «Материалы и методы исследования», заключения и

выводов. Список литературы содержит 283 источника, включая 264 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы посвящён описанию факторов, влияющих на иммунную

защиту в лёгких. Особое внимание уделено описанию роли сурфактантного белка

А, загрязнения воздушной среды и гендера.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали штаммы бактерий Klebsiella pneumoniae (ATCC

43816), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 39018) и Staphylococcus aureus (ATCC

25923).

Для стимулирования фагоцитоза in vitro использовали препараты белка

SP-A. Очистку нативного человеческого белка SP-A из бронхоальвеолярного ла-

важа, полученного от пациентов, больных альвеолярным протеинозом, проводили

по Huang (2002). Очистку рекомбинантных препаратов SP-А1 и SP-A2 проводили

методом аффинной хроматографии (Wang, 2002). Обработку белка SP-A озоном in

vitro и оценку уровня его окисления проводили по Umstead (2002).

Замену аминокислотного остатка в позиции 85 белка SP-A осуществляли

методом сайтнаправленного мутагенеза с помощью коммерческого набора Quik-

Change XL site-directed mutagenesis kit («Stratagene», США) согласно инструкции

производителя. Рекомбинантные конструкции транфецировали в T-REx-CHO

клетки (Wang, 2002) с помощью коммерческого набора «Lipofectamine Plus rea-

gent kit» («Invitrogen», США). Экспрессия SP-A каждым клоном анализировали с

помощью метода иммуноблоттинга.

13

Бронхоальвеолярный лаваж человека получали от пациентов, больных аль-

веолярным протеинозом, подвергавшихся рутинному терапевтическому лаважу

лёгких, а также в результате лаважа непригодных для трансплантации лёгких здо-

ровых доноров в медицинском центре Пенсильванского государственного меди-

цинского университета (Херши, США) (всего более 100 индивидуумов).

Для получения альвеолярных макрофагов использовали бронхоальвеоляр-

ный лаваж самцов крыс линии Sprague-Dawley весом 250-300 г. (более 200 живот-

ных) или лаваж из лёгких здоровых людей. Жизнеспособность макрофагов опре-

деляли с помощью окраски трипановым голубым, и использовали только клеточ-

ные суспензии с количеством жизнеспособных макрофагов на уровне более 95 %.

Уровень фагоцитоза in vitro оценивали с помощью метода световой микро-

скопии. Клетки и бактерии окрашивали при помощи набора HEMA-3 Stain Kit

(«Fisher Scientific», США). После подсчёта количества бактерий в 200 макрофагах

под иммерсией при 1000 увеличении (De Brauwer, 1999), фагоцитарный индекс

вычисляли по формуле Campbell (1994): процент макрофагов, содержащих по

крайней мере одну бактерию (позитивные макрофаги)  среднее количество бак-

терий на позитивный макрофаг. Фагоцитарный индекс затем выражали как про-

цент от негативного контроля (т.е., в отсутствии стимуляции фагоцитоза белком

SP-A), который принимали за 100 %. Уровень фагоцитоза in vitro также оценива-

ли с помощью метода проточной цитофлуориметрии (Fluorescence-Activated Cell

Sorter, FACS) после анализа 10.000 клеток с помощью программы «CellQuest»

(«Becton Dickson Immunometry Systems», США).

Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) проводили по

Laemmli (1970), а окраску белков серебром после проведения электрофореза осу-

ществляли согласно Rabilloud (1992). При проведении иммуноблоттинга, блоты

проявляли с помощью коммерческого набора фирмы «Bio-Rad» (США). При ана-

лизе SP-A1-специфичных антител, связывание антител было визуализировано с

помощью набора ECL «Enhanced Chemiluminescence detection kit» («General Bio-

science», США) и последующей экспозицией блотов на плёнку «Kodak X-Omat

XAR Film» («Kodak», США).

14

Куриные антитела (IgY), специфичные к SP-A1, были продуцированы ком-

панией «Aves Lab» (США). Для иммунизации кур использовали сконструирован-

ный нами пептид, состоящий из 21 аминокислотного остатка белка SP-A1 (Cys68-

Lys88). Антитела из куриного яичного желтка (IgY), специфичные к SP-A1, очи-

щали с помощью аффинной хроматографии.

Детекцию SP-A в культуре клеток (CHO)-К1, экспрессирующих рекомби-

нантные человеческие SP-A1 и SP-A2, осуществляли методом иммунофлуорес-

ценции с использованием конфокального микроскопа Leica TCS SP2 AOBS

(Leica, Германия). Анализ содержания SP-A1 в бронхоальвеолярном лаваже осу-

ществляли иммуноферментным методом (ELISA) с визуализацией с помощью ре-

агента OPD (O-phenylene diamine dihydrochloride).

Для оценки уровня иммунитета при пневмонии в эксперименте использова-

ли самцов и самок мышей линии C57BL/6J, а также изогенного варианта мышей,

лишённых гена SP-A (SP-A (-/-) нокаут мыши), на основе C57BL/6J (исходный

или «дикий тип») в возрасте 8-12 недель и в количестве более 1400 животных.

Ингалирование животных озоном в концентрации 2 ppm проводили в тече-

ние трёх часов в стеклянных камерах с автоматическим контролем концентрации

озона, температуры, влажности и скорости движения воздуха (Haque, 2007). Кон-

трольную группу мышей ингалировали фильтрованным воздухом вместо озона

одновременно с экспериментальной группой в тех же условиях. В каждом экспе-

рименте (более трёх в каждом опыте) использовали 10 мышей (5 для ингалирова-

ния озоном и 5 - воздухом); в экспериментах по оценке in vivo фагоцитоза исполь-

зовали 6 мышей (по 3 мыши из каждой группы). Непосредственно после обработ-

ки озоном или воздухом животные были внутритрахеально инфицированы сус-

пензией бактерий K. pneumoniaе в дозе 450 КОЕ/мышь в 50 мкл фосфатно-

солевого буфера. Для экспериментов по оценке фагоцитоза в условиях in vivo ис-

пользовали инфицирующую дозу 1,2 × 107 КОЕ/мышь в 50 мкл буфера.

Интегральный метод оценки состояния иммунитета включал ежедневный

анализ уровня выживаемости мышей после экспериментальной пневмонии в те-

чении 14 дней.

15

Для оценки уровня врождённого иммунитета, проводили анализ фагоцитоза

in vivo методом световой микроскопии. При этом альвеолярные макрофаги мышей

получали путём бронхоальвеолярного лаважа лёгких с помощью 0,5 мл 0,9 % рас-

твора NaCl спустя один час после инфицирования.

Для оценки микробиологического показателя иммунорезистентности ис-

пользовали количественный анализ бактериальной колонизации лёгких и диссе-

минации бактерий из лёгких при экспериментальной пневмонии путём подсчёта

КОЕ в серийно разведённых гомогенатах лёгких и селезёнки, а также крови через

12, 24 и 48 часов после инфицирования животных.

Оценку гистологических изменений в органах мышей проводили через 48

часов после их заражения. Для инфузии лёгких и фиксации тканей использовали

10 % раствор нейтрального забуференного формалина. Срезы тканей окрашивали

гематоксилином и эозином.

Определение содержания кортизола в плазме крови лабораторных мышей

было проведено через 12, 24 и 48 часов после их заражения бактериями

K. pneumoniaе с помощью коммерческого набора «Corticosterone 125 RIA» («MP

Biomedicals», США) согласно инструкции к набору.

Для оценки влияния половых гормонов на уровень иммунной защиты при

экспериментальной пневмонии, одну неделю спустя после проведения гонадэкто-

мии мышам имплантировали таблетированные экзогенные стероидные гормоны

противоположного пола производства компании «Innovative Research of America»

(США). Самкам мышей имплантировали препараты дигидротестостерона (5

мг/препарат), а самцам – эстрадиола (0,006 мг/препарат), высвобождающиеся в

течение 60 дней. Имплантацию осуществляли под кожу на латеральной стороне

шеи между ухом и плечом путём небольшого хирургического разреза. Одну неде-

лю спустя после проведённой имплантации мышей подвергали ингаляции озона

или воздуха, а затем инфицировали бактериями K. pneumoniaе.

Бронхоальвеолярный лаваж самцов и самок мышей использовали для ана-

лиза различных показателей. Общую концентрацию белка определяли с помощью

набора «Micro BCA Protein Assay Kit» («Pierce» США), концентрацию белка SP-A

16

в образцах - с помощью иммуноблоттинга с последующей лазерной денситомет-

рией и подсчётом величины оптической плотности × мм2. Уровень общего белко-

вого окисления определяли с помощью набора «OxyBlot Oxidized Protein Detection

Kit» («Intergen», США). Уровень окисления белка SP-A определяли по Robinson

(1999). Содержание фосфолипидов оценивали с помощью набора Phospholipids

Assay Kit («WAKO Chemicals Inc,» США) согласно инструкции производителя.

Концентрацию цитокина MIP-2 измеряли с помощью Quantikine mouse MIP-2

ELISA Kit «(R & D Systems», США) согласно инструкции производителя.

Уровень экспрессии белков в бронхоальвеолярном лаваже у лабораторных

мышей оценивали путём разделения белков методом двумерного электрофореза

(2D DIGE) с pH градиентами 4-7 и 7-11 и последующего анализа данных с ис-

пользованием программного обеспечения Progenesis SameSpots v2.0 software

(«Nonlinear Dynamics», США). Идентификацию белков осуществляли с помощью

масс-спектрометрического анализа (MALDI-ToF/Tof) и использования баз данных

NCBI и SwissProt. Функцию идентифицированных белков определяли с помощью

базы данных PANTHER, данных научной литературы и программы «Ingenuity

Pathway Analysis» («Ingenuity Systems», США).

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью статистиче-

ской программы «SigmaStat» («Systat Software Inc», США). Данные по выживае-

мости животных после экспериментальной пневмонии были анализированы с по-

мощью Log-rank теста, Chi-Square теста и Fisher’s exact теста. Соотношения срав-

нивали с помощью Z-теста. В остальных случаях, данные были обработаны с по-

мощью t-теста или Mann-Whitney rank sum теста, а также One Way ANOVA. Раз-

личия считали достоверными в случае, если p  0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ профагоцитарной активности SP-A1 и SP-A2

вариантов человека в условиях in vitro

Резидентные альвеолярные макрофаги и компоненты бронхоальвеолярной

жидкости в лёгких, такие как белок SP-A, находящиеся в постоянном контакте с

компонентами окружающей среды, составляют первую линию защиты против по-

17

падающих с воздухом в дыхательные пути патогенных микроорганизмов. Белок

SP-A, фактор врождённого иммунитета, играет ключевую роль в модулировании

иммунного ответа в лёгких при инфекционном процессе, и одной из его главных

функций является стимулирование фагоцитоза патогенных бактерий. У человека

SP-A кодируется двумя функциональными генами – SP-A1 и SP-A2, и разные ин-

дивидуумы могут иметь различный геноспецифический состав SP-A. Хотя из-

вестно, что суммарный белок SP-A, выделенный из бронхоальвеолярного лаважа

человека, повышает фагоцитоз бактерий, до сих пор не было установлено, отли-

чаются ли SP-A1 и SP-A2 варианты в их профагоцитарной активности. Поэтому с

целью изучения потенциального влияния геноспецифического состава SP-A на

уровень иммунной защиты у человека при пневмонии, первая глава исследования

посвящена оценке способности рекомбинантных SP-A1 и SP-A2 вариантов чело-

века стимулировать фагоцитоз альвеолярными макрофагами в условиях in vitro.

Для того, чтобы сравнить профагоцитарную активность SP-A1 и SP-A2 ва-

риантов in vitro методом световой микроскопии, в качестве модели использовали

крысиные альвеолярные макрофаги и бактерии P. aeruginosa, часто использую-

щиеся при изучении профагоцитарной активности белка SP-A in vitro. Кроме того,

бактерии P. aeruginosa могут вызывать пневмонию, особенно опасную для боль-

ных муковисцидозом. На рисунке 1 представлена репрезентативная микрофото-

графия фагоцитарной реакции в присутствии белка SP-A.

Рисунок 1 – Репрезентативная микрофотография фагоцитоза бактерий P.

aeruginosa крысиными альвеолярными макрофагами в отсутствие или присут-

ствии человеческого SP-A. Примечание: Стрелками показаны бактерии, фагоци-

тированные крысиными альвеолярными макрофагами in vitro; иммерсия, 1000.

18

В ходе анализа было выявлено, что SP-A2 варианты статистически досто-

верно стимулировали фагоцитоз в большей степени, чем SP-A1 варианты (Рису-

нок 2). Схожие результаты были получены и при использовании альвеолярных

макрофагов человека. Однако, фагоцитарная активность крысиных альвеолярных

макрофагов в ответ на стимулирование белком SP-A была в ~6 раз выше, чем ак-

тивность альвеолярных макрофагов человека. Результаты исследования фагоци-

тоза методом проточной цитофлуориметрии также свидетельствовали о том, что

SP-A2 обладает большей профагоцитарной активностью по сравнению с SP-A1.

Более того, в предварительных экспериментах с использованием трансгенных

мышей, несущих гены SP-A1 или SP-A2 человека вместо собственного гена SP-A,

нами было проведено исследование in vivo фагоцитоза спустя 1 час после инфи-

цирования животных бактериями K. pneumoniae. Было обнаружено, что альвео-

лярные макрофаги, полученные из лёгких мышей, несущих ген SP-A2, проявляли

более высокую фагоцитарную активность по сравнению с макрофагами живот-

ных, несущих ген SP-A1. Данные результаты свидетельствовали о более высокой

профагоцитарной активности SP-A2 по сравнению с SP-A1 и в условиях in vivo.

Рисунок 2 - Оценка фагоцитоза бактерий P. aeruginosa крысиными альвео-

лярными макрофагами в присутствии SP-A1 и SP-A2 вариантов. Примечание: Ис-

пользовали три различные концентрации (А, Б, В) рекомбинантных человеческих

SP-A1 (варианты 6А2 и 6А4) и SP-A2 (варианты 1А0 и 1А1). чSP-A – нативный че-

ловеческий SP-A из БАЛ (положительный контроль). Скобками показаны стати-

стически достоверные различия.

19

Одно из ключевых различий в последовательности аминокислотных остат-

ков между SP-A1 и SP-A2 находится в позиции 85, где SP-A1 имеет цистеин

(Cys85), а SP-A2 – аргинин (Arg85). Нами было предположено, что дополнительный

цистеин в SP-A1 может повлиять на структуру белка посредством образования

дополнительных дисульфидных связей, что в свою очередь, может оказать влия-

ние на функциональные различия между SP-A1 и SP-A2. В ходе экспериментов

выявлено, что замена аминокислотного остатка в позиции 85 (Arg85 на Cys85 в SP-

A2 и Cys85 на Arg85 в SP-A1) методом сайтнаправленного мутагенеза приводила к

тому, что SP-A1 по своей профагоцитарной активности становился эквивалент-

ным SP-A2, и наоборот (Рисунок 3). Следовательно, аминокислотный остаток в

позиции 85 отвечает за различную профагоцитарную активность SP-A1 и SP-A2.

Рисунок 3 - Оценка фагоцитоза бактерий P. aeruginosa крысиными альвео-

лярными макрофагами в присутствии 1А0 (SP-A2) и 6А2 (SP-A1) и их мутантных

(1А0(R85C) и 6A2(C85R)) вариантов. Примечание: Статистически достоверные раз-

личия показаны скобками. *Статистически достоверные различия между ак-

тивностью человеческого SP-A (чSP-A) и каждым из SP-A вариантов.

Таким образом, результаты проведённого исследования свидетельствуют о

том, что SP-A2 статистически достоверно стимулирует фагоцитоз бактерий аль-

веолярными макрофагами в большей степени, чем SP-A1, и аминокислотный

остаток в позиции 85 белка SP-A отвечает за данные функциональные различия.

Поскольку разные индивидуумы в человеческой популяции могут обладать раз-

20

ными соотношениями SP-A1 к SP-A2 в лёгких, данные различия в профагоцитар-

ной активности могут вносить существенный вклад в эффективность работы ме-

ханизмов иммунной защиты в лёгких и, соответственно, оказывать влияние на ва-

риабельность восприимчивости к пневмонии в популяции человека. Более того,

полученные результаты свидетельствуют о том, что суммарная активность чело-

веческого SP-A в лёгких зависит скорее от соотношения SP-A1 к SP-A2, чем от

общей концентрации SP-A (т.е. без учёта соотношения SP-A1 к SP-A2).

Оценка влияния озона на профагоцитарную активность белка SP-A и

его SP-A1 и SP-A2 вариантов in vitro

Дисфункция SP-A в результате его контакта с оксидантами, такими как

озон, может являться одним из факторов, вносящих вклад в повышенный риск

госпитализации больных пневмонией пациентов в случае повышенной концен-

трации озона в воздухе (Fischer, 2003; Peel, 2005; Medina-Ramon, 2006). В данной

главе была исследована гипотеза о том, что способность белка SP-A стимулиро-

вать фагоцитоз зависит от степени его in vivo или in vitro окисления, и что обра-

ботка озоном в качестве окислителя в различной степени влияет на профагоци-

тарную активность SP-A1 и SP-A2. Для этого была изучена профагоцитарная ак-

тивность препаратов SP-A из бронхоальвеолярного лаважа различных индивиду-

умов и имеющих разную степень окисления in vivo (в лёгких), а также препаратов

SP-A из бронхоальвеолярного лаважа человека и препаратов SP-A1 и SP-A2, об-

работанных in vitro озоном.

Нами были исследованы 10 различных препаратов чSP-A, выделенных от 6

пациентов, больных альвеолярным протеинозом. При этом, от пациентов № 2 и

№ 6 были изучены по 3 различных препарата (Рисунок 4). В результате анализа

полученных данных была выявлена негативная корреляция между уровнем окис-

ления белка SP-A и его способностью стимулировать фагоцитоз (коэффициент

корреляции Пирсона был равен -0,7, p 0,05) (Рисунок 4А). В случае усреднения

данных от пациентов № 2 и № 6 и последующего анализа, коэффициент негатив-

ной корреляции был выше: -0,9 (p 0,05) (Рисунок 4Б).

21

Один из наименее окисленных препаратов чSP-A (№ 6-2*) был далее до-

полнительно окислен in vitro при использовании различных концентраций озона

(0,01; 0,1; 1 и 10 ppm). Как и в случае с окисленными in vivo препаратами чSP-A,

было обнаружено, что с увеличением индуцированного озоном in vitro уровня

окисления чSP-A, его способность стимулировать фагоцитоз снижалась (коэффи-

циент корреляции был равен -0,9 при p0,05) (Рисунок 5). Следовательно, как in

vivo, так и in vitro, окисление чSP-A приводило к снижению его профагоцитарной

активности. Таким образом, в данном исследовании показано наличие статисти-

чески достоверной негативной корреляции между in vivo (в лёгких) и in vitro

уровнями окисления чSP-A и его способностью стимулировать фагоцитоз. Следо-

вательно, оксиданты, в частности, озон, могут снижать профагоцитарную актив-

ность SP-A, что, в свою очередь, может приводить к снижению уровня иммуните-

та при пневмонии и повышению тяжести заболевания.

Рисунок 4 - Корреляция профагоцитарной активности и степени окисления

in vivo человеческого SP-A из бронхоальвеолярного лаважа. Примечание: Уровень

окисления SP-A представлен как произведение оптической плотности (ОП) на

мм2 блота каждого препарата. А и Б - зависимость уровня фагоцитоза бакте-

рий P. aeruginosa от степени окисления SP-A, В – оксиблот, показывающий сте-

пень белкового окисления.

22

Рисунок 5 - Корреляция профагоцитарной активности и степени окисления

in vitro человеческого SP-A из бронхоальвеолярного лаважа озоном. Примечание:

А - зависимость уровня фагоцитоза бактерий P. aeruginosa от степени окисле-

ния SP-A, Б – уровень белкового окисления на оксиблоте. И и В -интактный и об-

работанный воздухом препараты, соответственно.

Известно, что белок SP-A связывается с различными рецепторами на по-

верхности грамотрицательных и грамположительных бактерий. Полученные нами

данные выявили, что индуцируемые озоном окислительные модификации в

структуре SP-A снижают его профагоцитарную активность в отношении как гра-

мотрицательных (P. aeruginosa), так и грамположительных (S. aureus) бактерий.

Следовательно, воздействие озона может приводить к снижению эффективности

связанных с действием SP-A механизмов врождённого иммунитета, направлен-

ных как против грамположительных, так и против грамотрицательных бактерий.

Следующей задачей было изучение влияния озона на профагоцитарную ак-

тивность SP-A1 и SP-A2. Физиологическая концентрация SP-A в бронхоальвео-

лярном лаваже лёгких здоровых людей составляет около 0,2-16 мг/л (Hermans,

1999). Учитывая приблизительно 100-кратное разведение в результате процедуры

взятия бронхоальвеолярного лаважа (Hermans, 1999), эпителиальная жидкость

лёгких содержит около 20-1600 мкг/мл SP-A. Поскольку известно, что содержа-

ние белка SP-A при различных заболеваниях лёгких может снижаться ниже фи-

зиологической концентрации (Khubchandani, 2001; Korfhagen, 2001), препараты

SP-A1 и SP-A2 были нами использованы в трёх различных концентрациях ниже

физиологической нормы: 5, 10 и 20 мкг/мл. Было обнаружено, что, несмотря на

23

изначально более высокую профагоцитарную активностью SP-A2 по сравнению с

SP-A1, обработка озоном приводила к стиранию данных различий при использо-

вании SP-A в концентрациях 5 или 10 мкг/мл (Рисунок 6).

Рисунок 6 – Оценка фагоцитоза бактерий P. aeruginosa крысиными альвео-

лярными макрофагами в присутствии обработанных in vitro озоном SP-A из брон-

хоальвеолярного лаважа человека или SP-A1 и SP-A2 вариантов. Примечание: А -

уровень окисления SP-A. Б - уровень фагоцитоза в присутствии SP-A (% от кон-

троля). Контр. – контроль, фагоцитоз в отсутствие SP-A. И, В и О3 - интакт-

ный (необработанный), обработанный воздухом или обработанный озоном SP-A,

соответственно; чSP-A – человеческий SP-A из БАЛ. Скобками показаны досто-

верные (p 0,05) различия; *не отличается от контроля (в отсутствии SP-A).

Данный факт свидетельствовал о том, что воздействие озона может приво-

дить к нивелированию более высокой функциональной активности SP-A2 по

сравнению с SP-A1 при низких концентрациях SP-A. С целью паритетного по ак-

тивности сравнения, показатели фагоцитарного индекса для SP-A1 (5, 10, 20

Концентрация SP-A (мкг/мл)

5

10

20

45,05  5,07

59,50  5,22

63,32  2,11

56,69  6,61

64,24  1,76

68,10  0,40

85,43  9,34*

80,99  7,73*

71,77  5,06*

84, 56  9,64

84,12  7,56

78,75  1,32**

Соотношение ФИ

1A0 (SP-A2)

озон/интактный (%)

озон/воздух (%)

6A4 (SP-A1)

озон/интактный (%)

озон/воздух (%)

24

мкг/мл) также сравнивали с данными фагоцитарного индекса для минимальной

концентрации SP-A2 – 5 мкг/мл. При этом было обнаружено, что величины соот-

ношения озон/интактные и озон/воздух для SP-A2 были статистически достовер-

но ниже, чем соответствующие величины для SP-A1 (Таблица 1). Следовательно,

анализ полученных данных свидетельствовал о том, что обработка озоном снижа-

ла профагоцитарную активность SP-A2 в большей степени, чем SP-A1.

Таблица 1 - Анализ влияния обработки препаратов SP-A1 и SP-A2 вариан-

тов озоном in vitro на их профагоцитарную активность

Примечание: ФИ – фагоцитарный индекс; *достоверные различия между

соотношениями «1А0 озон / интактный» в концентрации 5 мкг/мл и каждого со-

отношения «6А4 озон / интактный» в концентрациях 5, 10 и 20 мкг/мл; **то же,

что и «*», но для сравнения соотношений «озон /воздух» между препаратами 1А0

и 6А4.

Таким образом, снижение активности SP-A вследствие его окисления озо-

ном может объяснять описанный в литературе более высокий риск развития

пневмонии в случае регистрации повышенного уровня озона в воздухе (Fischer,

2003; Peel, 2005; Medina-Ramon, 2006). Полученные результаты также позволяют

предполагать, что в случае загрязнения атмосферного воздуха оксидантами им-

муномодулирующая активность белка SP-A поражается в различной степени у

разных индивидуумов в зависимости от состава SP-A (содержания SP-A1 и SP-

A2). Индивидуумы, имеющие большее количество SP-A2, чем SP-A1 в их лёгких,

и, следовательно, более высокий исходный уровень иммунной защиты в лёгких,

могут потерять их генетическое преимущество в случае проживания в местах, ха-

рактеризующихся высоким уровнем загрязнения атмосферного воздуха озоном.

25

Более того, в случае, если у пациентов выявлено низкое содержание SP-A вслед-

ствие развития различных заболеваний, то должно приниматься во внимание вли-

яние загрязнения атмосферного воздуха, в частности озоном, на иммуномодули-

рующую активность белка SP-A, и на иммунный статус лёгких в целом.

Получение антител, специфичных к SP-A1, и оценка влияния различ-

ных факторов на геноспецифический состав SP-A в лёгких человека

Задачей следующего раздела работы было получение и характеристика ан-

тител для их использования с целью оценки геноспецифического состава SP-A в

бронхоальвеолярной жидкости лёгких человека. Для этого были получены полик-

лональные куриные антитела (IgY), специфичные к SP-A1 (чSP-A1_Ab68-88_Col).

Их специфичность к SP-A1 была подтверждена с помощью иммуноферментного

метода (ELISA) и методов иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции. С помо-

щью полученных к SP-A1 антител нами выявлено, что различные факторы могут

влиять на геноспецифический состав SP-A в лёгких человека. В частности, с воз-

растом человека может изменяться не только общее содержание SP-A (SP-A1 +

SP-A2) в лёгких, но и относительное содержание SP-A1 и SP-A2. Таким образом,

полученные антитела, высоко специфичные к SP-A1, одному из генных продуктов

SP-A, могут быть полезны при анализе геноспецифического соcтава SP-A в ис-

следуемых образцах, поскольку относительное содержание SP-A1 и SP-A2, а не

общее количество SP-A в лёгких, отражает общую функциональную активность

SP-A и, соответственно, уровень иммунной защиты в лёгких у человека.

Изучение иммуномодулирующего влияния белка SP-A на уровень им-

мунной защиты при экспериментальной пневмонии в условиях окислитель-

ного стресса

Экспериментальные модели на мышах часто используются для изучения

процессов, происходящих при пневмонии у человека, поскольку молекулярные

механизмы, участвующие в иммунной защите в лёгких, у мышей и у человека во

многом схожие (Mizgerd, 2008). В то же время, следует помнить об определённых

ограничениях в экстраполировании данных, полученных на мышах, на популя-

цию человека в связи с видовыми различиями. Тем не менее, значительное пре-

26

имущество моделирования пневмонии на мышах включает как использование ге-

нетически модифицированных животных, в организме которых может быть ис-

следована роль определённых молекул, таких как SP-A, так и возможность прове-

дения исследований в контролируемых условиях, которые невозможно осуще-

ствить на популяции человека, например, исследование пневмонии в условиях

специфического воздействия на механизмы иммунной защиты в лёгких.

В данной главе приводятся результаты исследования одновременного влия-

ния SP-A, ингаляции озона и половой принадлежности на уровень выживаемости

животных от пневмонии, как интегрального метода оценки иммунитета. Самцов и

самок SP-A (-/-) мышей (лишённых гена SP-A) и мышей «дикого типа» (исходный

тип) ингалировали озоном (или воздухом в качестве контроля), а затем инфици-

ровали бактериями K. pneumoniae. Данного возбудителя использовали в качестве

модели инфекционного агента из-за высокой чувствительности лабораторных

мышей к нему и, поскольку, по данным литературы, инфекция, вызванная бакте-

риями K. pneumoniae часто являлась причиной смертности у больных пневмонией

пациентов (Иванчик Н.В., 2008). В предварительных экспериментах нами было

выявлено, что инфицирующая доза бактерий, равная 450 КОЕ/мышь является оп-

тимальной, поскольку она обеспечивала ~ 50 % смертность интактных животных

спустя 14 дней после заражения. При этом ингаляция озона или воздуха с после-

дующей внутритрахеальной инъекцией раствора фосфатно-солевого буфера вме-

сто суспензии бактерий (т.е. без инфицирования), не оказывало влияния на пове-

дение животных и не приводило к их гибели в течение 14 дней наблюдения.

Поскольку SP-A играет ключевую роль в регулировании механизмов им-

мунной защиты в лёгких, а озон, являясь одним из ключевых загрязнителей атмо-

сферного воздуха, обладает значительными оксидантными свойствами, нами бы-

ло предположено, что отсутствие гена SP-A у мышей или снижение функции бел-

ка SP-A путём его окислительной модификации в условиях ингаляции озона ока-

зывают негативное влияние на восприимчивость мышей к пневмонии, и что в

условиях индуцируемого озоном окислительного стресса существуют половые

различия в уровне иммунной защиты при экспериментальной пневмонии. При

27

этом необходимо принять во внимание тот факт, что, в отличие от человека, у

грызунов, обычно используемых в качестве биомодельных животных при иссле-

довании различных заболеваний человека, включая пневмонию, SP-A кодируется

не двумя (SP-A1 и SP-A2), а одним функциональным геном.

Результаты исследования влияния SP-A на уровень иммунорезистентности

лишённых гена SP-A мышей при пневмонии выявили, что SP-A (-/-) мыши имели

более низкий уровень выживаемости по сравнению с мышами «дикого типа» (Ри-

сунок 7). В то же время, в профиле выживаемости от пневмонии мы выявили

схожий тренд для мышей обоих типов.

Рисунок 7 – Влияние ингаляции озона на уровень выживаемости SP-A (-/-)

мышей и мышей «дикого типа» от пневмонии. Примечание: Процент выживших

после пневмонии животных показан для каждого дня после инфицирования. До-

стоверные различия в уровнях выживаемости между обработанными озоном и

воздухом мышей определяли с помощью log-rank теста (#, выживаемость в те-

чение 14 дней) и Fisher’s Exact теста (*, выживаемость для каждого дня). Было

проведено 8 независимых экспериментов.

28

Анализ кривых выживаемости показал, что животные обоих полов после

ингаляции озона становились более восприимчивыми к пневмонии по сравнению

с контролем (ингаляция воздуха). При этом, хотя выживаемость ингалированных

воздухом самок от пневмонии была выше, чем самцов (самки самцы), ингаляция

озона изменяла этот тренд на противоположный: самки становились более вос-

приимчивыми к пневмонии, чем самцы (самки самцы). Поэтому расстояние

между кривыми выживаемости от пневмонии после ингаляции воздуха (контроль)

и ингаляции озона, отражающее модулирующий эффект озона по сравнению с

контролем, оказалось значительно больше для самок, чем для самцов (Рисунок 7).

С целью анализа уровня выживаемости от пневмонии между самцами и самками

мышей в условиях окислительного стресса, сравнивали соотношения «выживае-

мость после ингаляции озона / выживаемость после ингаляции воздуха × 100 %»

(т.е. процент от контроля) для каждого дня после инфицирования. Анализ выявил,

что риск смертности от пневмонии после ингаляции озона был выше (p 0,05) у

самок по сравнению с самцами (Рисунок 8). На основании анализа полученных

данных было сделано заключение, что особи женского пола более подвержены

риску неблагоприятного развития пневмонии в условиях окислительного стресса.

Рисунок 8 – Влияние пола на уровень выживаемости SP-A (-/-) мышей и

мышей «дикого типа» от пневмонии после ингаляции озона. Примечание: Дан-

ные, описанные на рисунке 7, представлены как процент от контроля. Выжива-

емость мышей от пневмонии в контрольной группе (после ингаляции воздуха) бы-

ла установлена как 100 % и выживаемость в соответствующей группе живот-

ных после ингаляции озона была вычислена по формуле: озон/воздух × 100 %. Аб-

солютные величины соотношений выживаемости были сравнены с помощью z-

теста для каждого дня исследования и статистически достоверные различия

обозначены звёздочкой *.

29

Таким образом, результаты проведённого исследования показали, что вы-

живаемость мышей обоих полов от пневмонии снижается после ингаляции озона.

Однако, несмотря на то, что мужской пол, как известно, является одним из факто-

ров риска при пневмонии, в условиях окислительного стресса, вызванного вдыха-

нием озона, ситуация изменяется на противоположную – фактором риска при

пневмонии становится женский пол. Эти результаты свидетельствуют о влиянии

загрязнения воздуха, в том числе озоном, на повышении восприимчивости к лё-

гочной инфекции и подчёркивают необходимость рассмотрения гендера как важ-

нейшего фактора в случае исследования влияния загрязнения воздушной среды на

иммунную защиту в лёгких у человека. Представленные данные позволяют пред-

полагать, что антропогенное загрязнение воздушной среды городов, например,

озоном, может приводить к снижению эффективности работы механизмов им-

мунной защиты в лёгких у пациентов женского пола в большей степени, чем у

мужского, что может обусловливать необходимость проведения своевременных

профилактических мероприятий и лечения, направленных на снижение тяжести

течения пневмонии. Более того, результаты исследования свидетельствуют о том,

что SP-A является одним из факторов, определяющих уровень иммунной защиты

при пневмонии, в том числе, в условиях окислительного стресса.

Фагоцитоз является одним из наиболее важных механизмов врождённого

иммунитета в лёгких при пневмонии. Поэтому нами была проведена сравнитель-

ная оценка уровней фагоцитоза in vivo (в лёгких) бактерий K. pneumoniae альвео-

лярными макрофагами мышей в условиях окислительного стресса. Было обнару-

жено, что ингаляция озона приводила к снижению (p 0,05) уровня фагоцитоза

бактерий альвеолярными макрофагами при пневмонии у животных обоих полов.

При этом данное снижение было более выражено у самок по сравнению с самца-

ми (p 0,05), что может вносить вклад в половые различия в уровне иммунной

защиты при пневмонии в условиях ингаляции озона (Рисунок 9). Кроме того, уро-

вень фагоцитоза у SP-A (-/-) мышей был статистически достоверно ниже по срав-

нению с мышами «дикого типа», что свидетельствовало об иммуномодулирую-

щем влиянии белка SP-A.

30

Рисунок 9 - Уровень in vivo фагоцитоза бактерий K. pneumoniae альвео-

лярными макрофагами, выделенными из лёгких SP-A (-/-) мышей и мышей «дико-

го типа» после обработки озоном или воздухом. Примечание: Пунктирной линией

обозначен схожий уровень фагоцитоза. Достоверные различия (t-тест) показаны

скобками. Было проведено 4 независимых эксперимента.

Прогноз лёгочной инфекции зависит от многих факторов антибактериаль-

ной защиты, включая эффективное уничтожение патогенных бактерий в лёгких и

ограничение системной внелёгочной диссеминации возбудителя. Бактерии

K. penumoniae являются одним из часто встречающихся патогенов респираторно-

го тракта (Podschun, 1998; Kofteridis, 2004). Пневмония, вызванная этим микроор-

ганизмом, трудно излечима, особенно в случае пациентов с иммунодефицитными

состояниями. Диссеминация бактерий K. pneumoniae в кровяное русло – критиче-

ский момент в патогенезе инфекции, поскольку это может приводить к полиор-

ганной недостаточности (Yinnon, 1996). При исследовании микробиологического

показателя иммунорезистентности при пневмонии в условиях окислительного

стресса у SP-A (-/-) мышей и мышей «дикого типа» в течение первых двух дней

после инфицирования был выявлен схожий тренд. Во-первых, ингаляция озона

приводила к снижению эффективности элиминирования патогенных бактерий из

лёгких, особенно у самок. Во-вторых, в отсутствие обработки озоном, у самцов

наблюдался более высокий уровень диссеминации бактерий в кровь и селезёнку

(Рисунок 10).

31

Рисунок 10 – Величины колониеобразующих единиц в лёгких, селезёнке и

крови у обработанных озоном или воздухом мышей в различные сроки после ин-

фицирования бактериями K. penumoniae. Примечание: О3 и В - ингаляция озона

или воздуха, соответственно. КОЕ рассчитывали на 20 мкл цельного гомогената

органов или цельной крови (до серийного разведения). Достоверные различия по-

казаны скобками. «ДТ» - мыши «дикого типа». O3, П и ДТ-SP-A (-/-) под скобками

- различия между животными, обработанными озоном и обработанными возду-

хом (влияние озона), между самцами и самками (влияние пола), между мышами

«дикого типа» и SP-A нокаут мышами (влияние SP-A), соответственно. Для

статистических целей, сравнивались данные, трансформированные в log10, ис-

пользуя t-тест (или Mann-Whitney Rank Sum тест*). **достоверные различия

между нетрансформированными данными (Mann-Whitney Rank Sum тест). В слу-

чае, если величина КОЕ была равна нулю, log10 таких данных был приравнен к ну-

лю. Было проведено 3 независимых эксперимента для каждой группы (четыре для

самок «ДТ» через 24 ч после инфицирования).

Таким образом, данное исследование свидетельствует о том, что ингаляция

озона приводит к снижению устойчивости лёгких к бактериальной колонизации, и

что существуют половые различия в микробиологическом показателе иммуноре-

32

зистентности при пневмонии у мышей в условиях ингаляции животных воздухом

или озоном.

С целью дальнейшего анализа механизмов, вызывающих изменения, кри-

тичные для отмеченных выше половых различий и различий между мышами «ди-

кого типа» и SP-A (-/-) мышами, в уровне их выживаемости и фагоцитарной

функции макрофагов, анализировали бронхоальвеолярный лаваж, полученный от

обработанных воздухом или озоном мышей «дикого типа» спустя 1 час после

введения им раствора натрий-фосфатного буфера вместо бактериальной суспен-

зии. Исследование БАЛ выявило, что в ответ на ингаляцию озона у самцов мышей

повышалась суммарная концентрация белков, а у самок по сравнению с самцами

повышалось содержания SP-A в БАЛ. При этом анализ влияния озона на уровень

белкового окисления и на уровень окисления SP-A в БАЛ выявил, что ингаляция

озона приводила к статистически достоверному повышению уровня окисления

белка SP-A (но не суммарного белка) в БАЛ самок. При этом уровень окисления

SP-A у самок был выше, чем у самцов (Рисунок 11).

Рисунок 11 - Влияние озона на уровень окисления SP-A и белков брон-

хоальвеолярного лаважа. Примечание: Данные для мышей, обработанных озоном,

представлены как процент от контроля (ингаляция воздуха). Достоверные раз-

личия (t-тест) показаны скобками. Было проведено 4 независимых эксперимента.

В результате масс-спектрометрического анализа бронхоальвеолярного ла-

важа у SP-A (-/-) мышей и мышей «дикого» типа было идентифицировано и оха-

33

рактеризовано 60 белков. Результаты исследования выявили, что экспрессия

большинства белков, участвующих в регуляции иммунной защиты и окислитель-

но-восстановительного баланса в лёгких у SP-A (-/-) мышей, снижена по сравне-

нию с мышами «дикого типа». Это свидетельствовало о том, что лишённые SP-A

животные могут быть более чувствительны как к инфицированию, так и к воздей-

ствию оксидантов при пневмонии по сравнению с генетически полноценными

животными и указывало на ключевую роль SP-A в регулировании иммунной за-

щиты и окислительно-восстановительного баланса в лёгких.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что блокирова-

ние синтеза SP-A в лёгких (в результате элиминирования гена SP-A у SP-A (-/-)

мышей) или снижение функциональной активности SP-A (в результате окисления

SP-A у мышей «дикого типа») приводят к снижению иммунорезистентности мы-

шей при пневмонии в эксперименте. Кроме того, результаты, представленные в

данной главе, выявили, что существуют половые различия в иммунорезистентно-

сти при пневмонии и фагоцитирующей способности альвеолярных макрофагов в

ответ на индуцируемый озоном окислительный стресс и что особи женского пола

находятся в зоне риска. Более того, представленные исследования указывают на

важную роль SP-A в регулировании окислительного стресса и функции макро-

фагов. Вышеизложенное позволяет предполагать, что поражение врождённого

компонента иммунитета, связанного с функцией SP-A, может привести к пробле-

мам, связанным с купированием пневмонийной инфекции перед лицом оксидант-

ных стрессорных факторов окружающей среды, особенно в лёгких особей жен-

ского пола. Данная работа свидетельствует о необходимости учитывать половые

различия при проведении подобных исследований и при планировании профилак-

тики и лечения пациентов, больных пневмонией.

Оценка влияния половой принадлежности на уровень иммунной защи-

ты при экспериментальной пневмонии в условиях оксидантной нагрузки

Результаты исследований, представленных в предыдущей главе, позволяют

предполагать, что за половые различия в уровне выживаемости животных при

пневмонии в условиях окислительного стресса могут отвечать как половые разли-

34

чия в уровне фагоцитоза, так и половые различия в уровне бактериальной колони-

зации лёгких и диссеминации бактерий из лёгких в течение пневмонии. Белок SP-

A также может быть вовлечён в детерминирование половых различий в уровне

иммунной защиты при пневмонии в условиях оксидантной нагрузки, т.к. выявле-

ны различия в уровне экспрессии SP-A и степени его окисления в лёгких у жи-

вотных разного пола в ответ на ингаляцию озона. Поскольку низкая функцио-

нальная активность SP-A вследствие его окисления озоном может приводить к

«неадекватному» иммунному ответу при пневмонии, этот иммуномодуляторный

белок может являться одним из критических факторов, влияющих на гендерспе-

цифический уровень иммунитета при пневмонии в условиях присутствия окси-

дантов в воздушной среде. Полученные данные позволяют предполагать, что в

условиях окислительного стресса половая принадлежность может оказывать су-

щественное влияние на уровень иммунной защиты при пневмонии у человека. С

целью дальнейшего исследования механизмов, отвечающих за половые различия

в уровне иммунной защиты при пневмонии в условиях окислительного стресса,

нами была поставлена серия экспериментов на модели мышей «дикого типа» (т.е.

полноценных, имеющих SP-A в лёгких).

Известно, что стресс является иммуномодулирующим фактором (Elenkov,

2002), и гормоны стресса, глюкокортикоиды, ингибируют продукцию Th1 цито-

кинов (регулируют клеточно-опосредованный компонент иммунитета) и индуци-

руют продукцию Th2 цитокинов (регулируют гуморальный компонент иммуните-

та) лимфоцитами (Spellberg, 2001; Elenkov, 2002). Поэтому следующий раздел ра-

боты был посвящён исследованию содержания кортизола в плазме крови живот-

ных, инфицированных бактериями K. pneumoniae, в условиях окислительного

стресса, вызванного ингаляцией озона. В ходе анализа выявлено, что содержание

кортизола в плазме крови животных в представленной экспериментальной модели

пневмонии зависело как от половой принадлежности, так и от наличия окисли-

тельного стресса. При этом ингаляция озона приводила к повышению концентра-

ции кортизола в крови у самок мышей, но не у самцов в течении пневмонии (Ри-

сунок 12). Поскольку кортизол ингибирует продукцию Th1 цитокинов, участву-

35

ющих в механизмах клеточно-опосредованного иммунитета, повышенная концен-

трация кортизола в крови обработанных озоном самок мышей после инфицирова-

ния бактериями K. pneumoniae может являться одним из факторов, отвечающих за

сниженный уровень клеточного компонента иммунитета при пневмонии у пред-

ставителей женского пола в условиях окислительного стресса.

Рисунок 12 – Концентрация кортизола в плазме крови у обработанных озо-

ном или воздухом мышей «дикого типа» в различные сроки после инфицирования

бактериями K. pneumoniae. Примечание: В и О3 – обработанные воздухом или

озоном животные, соответственно. Сравнения проводили с помощью t-теста

(или Mann-Whitney Rank Sum теста, *). Различия (p 0.05) показаны скобками.

O3 и П под скобками - эффект озона или пола, соответственно как описано в

подписи к рисунку 14. Было проведено 3 независимых эксперимента.

Функционирование эффективной иммунной защиты от патогенных микро-

организмов в лёгких находится под влиянием различных показателей в брон-

хоальвеолярной жидкости. Поэтому нами было исследовано влияние ингаляции

озона при пневмонии на некоторые показатели в бронхоальвеолярном лаваже у

животных спустя 4, 24 и 48 часов после инфицирования бактериями K. pneumoni-

ae. Было определено количество нейтрофилов, общее содержание белков и уро-

вень их окисления, содержание SP-A и уровень его окисления, содержание фос-

фолипидов, а также хемокина MIP-2 в бронхоальвеолярном лаваже. Было выявле-

но, что ингаляция озона приводит к повышению большинства исследуемых пока-

зателей по сравнению с контролем (ингаляция воздуха), что свидетельствует о

более выраженном воспалительном ответе в лёгких в условиях окислительного

стресса. Однако, в большинстве случаев у самок и самцов регистрировали схожий

36

тренд изменений в ходе пневмонии в условиях как наличия, так и отсутствия

окислительного стресса, вызванного воздействием озона.

Целью следующего раздела работы была гистологическая оценка факторов,

влияющих на эффективность иммунной защиты при пневмонии у самок и самцов

мышей после ингаляции озона. Для этого было проведено сравнительное иссле-

дование гистологических изменений в лёгких и экстрапульмонарных органах (се-

лезёнке и печени) через 48 часов после заражения животных бактериями K. pneu-

moniae (непосредственно перед массовой гибелью животных от пневмонии) в от-

сутствие или при наличии окислительного стресса, вызванного ингаляцией озона.

Было обнаружено, что различия между ингалированными озоном или воздухом

животными при экспериментальной пневмонии включают не только различия в

характере изменений в лёгких как первично инфицированном органе (Рисунок 13,

Таблица 2), но в экстрапульмонарных органах, таких как селезёнка и печень (Таб-

лица 2). Выраженное воспаление в лёгких, приводящее к возможным тканевым

повреждениям, может объяснять снижение иммунорезистентности при экспери-

ментальной пневмонии у животных обоих полов в условиях ингаляции озона. Бо-

лее того, при анализе влияния половой принадлежности выявлено, что у обрабо-

танных воздухом и инфицированных K. pneuminiae самцов мышей риск развития

патологических изменений в экстрапульмонарных органах (селезёнке и печени)

был выше, чем у самок, в то время как у обработанных озоном и зараженных бак-

териями K. pneuminiae самок мышей было отмечено более выраженное воспале-

ние в лёгких по сравнению с самцами.

На основании полученных результатов были сделаны следующие выводы:

1) выраженное воспаление в лёгких может обусловливать неблагоприятное разви-

тие пневмонии у обработанных озоном мышей обоих полов по сравнению с жи-

вотными, ингалированными воздухом; 2) повышенный риск развития патологиче-

ских изменений в экстрапульмонарных органах (в селезёнке и печени), возможно,

вследствие более высокой диссеминации бактерий из лёгких при пневмонии, мо-

жет вносить вклад в неблагоприятное развитие экспериментальной пневмонии у

самцов по сравнению с самками после ингалирования воздуха; 3) выраженное

Примечание: в числителе обозначено количество мышей с изменениями, а в

знаменателе – общее количество животных в группе. Для каждой группы было

проведено три независимых эксперимента.

37

воспаление в лёгких может вносить вклад в неблагоприятное развитие пневмонии

у самок по сравнению с самцами после ингалирования озона.

Рисунок 13 – Размеры очагов и степень выраженности воспаления в лёгких

у инфицированных K. pneumoniae самцов и самок мышей в отсутствие или при

наличии окислительного стресса вследствие ингалирования озоном. Примечание:

Область поражения лёгких, а также степень воспаления были выражены в бал-

лах. Данные, показанные в панели А, представлены в панели Б как процент от

контроля (эффект озона за вычетом фоновых данных) для каждого пола, соглас-

но формуле: ингаляция озона / ингаляция воздуха × 100 %. Достоверные различия

(t-тест) для трёх независимых экспериментов показаны скобками.

Таблица 2 - Оценка гистологических изменений в лёгких, печени и селезён-

ке у обработанных озоном или воздухом и инфицированных бактериями K. pneu-

moniae мышей

Лёгкие

Ингалиро-

вание

Воздух

Озон

Воздух

Озон

Пол

Самцы

Самки

1/14

0/14

5/14

9/14

8/14

3/14

7/14

1/14

3/14

4/14

0/11

1/11

4/11

4/11

5/11

0/14

4/14

3/14

4/14

1/14

38

На следующем этапе исследований было предположено, что гонадные гор-

моны отвечают за половые различия в уровне иммунной защиты при пневмонии в

условиях окислительного стресса. Для проверки данной гипотезы, у мышей сна-

чала удаляли половые железы, а затем гонадэктомированным животным вводили

половые гормоны противоположного пола: гонадэктомированным самкам были

имплантированы

таблетированные

коммерческие

препараты

5α-

дигидротестостерона, а гонадэктомированным самцам - таблетированные ком-

мерческие препараты 17β-эстрадиола. Интегральный метод оценки состояния им-

мунитета включал ежедневный анализ уровня выживаемости мышей после пнев-

монии в условиях оксидантной нагрузки в течении 14 дней. В результате данного

исследования было выявлено, что по профилям уровней выживаемости после

пневмонии гонадэктомированные самки, имплантированные препаратом дигид-

ротестостерона, мимикрировали интактных самцов, а гонадэктомированные сам-

цы, имплантированные препаратом эстрадиола, мимикрировали интактных самок.

Следовательно, результаты данного исследования свидетельствуют о том, что по-

ловые гормоны влияют на уровень иммунной защиты при экспериментальной

пневмонии в условиях окислительного стресса.

Таким образом, результаты проведённых исследований, описанных в дан-

ной главе, позволили заключить, что различные факторы могут влиять на уровень

иммунной защиты при пневмонии у представителей разного пола в зависимости

от наличия окислительного стресса, вызванного ингаляцией озона. Данные, полу-

ченные в эксперименте, позволяют оценить возможные факторы, влияющие на

иммунорезистентность при пневмонии у человека в условиях отсутствия или

наличия окислительного стресса, для обеспечения своевременного проведения

профилактических мероприятий и лечения пациентов, больных пневмонией.

Экспериментальная модель, описывающая общие и гендерспецифиче-

ские факторы, влияющие на уровень иммунной защиты при пневмонии в

условиях оксидантной нагрузки

На основе экспериментальных данных, полученных нами в результате ком-

плексной оценки факторов, участвующих в модулировании иммунной защиты в

39

лёгких, в условиях in vitro и in vivo выявлены общие и гендерспецифические фак-

торы, влияющие на уровень иммунной защиты при пневмонии в зависимости от

наличия или отсутствия окислительного стресса, вызванного ингаляцией озона.

Общие (для обоих полов) факторы, влияющие на уровень иммунной за-

щиты при пневмонии (Рисунок 14). В отсутствие окислительного стресса, од-

ним из таких факторов может быть уровень иммуномодулирующей активности

белка SP-A. Геноспецифический состав SP-A, т.е. уровень экспрессии SP-A1 и SP-

A2 в лёгких, может оказывать значительное влияние на общую иммуномодули-

рующую активность SP-A, в частности, на его профагоцитарную активность, и,

следовательно, на уровень иммунной защиты у представителей обоих полов при

пневмонии. Поскольку SP-A2 обладает более выраженной профагоцитарной ак-

тивностью по сравнению с SP-A1, соотношение SP-A1 к SP-A2 в лёгких может

иметь существенное значение для иммунной защиты при пневмонии в отсутствие

окислительного стресса.

Рисунок 14 – Общие для мужского и женского пола факторы, влияющие на

уровень иммунной защиты при пневмонии в отсутствие или при наличии окисли-

тельного стресса, вызванного воздействием озона (модель).

В условиях окислительного стресса, вызванного ингаляцией озона, общие

для обоих полов факторы могут включать снижение эффективности фагоцитоза

40

бактерий альвеолярными макрофагами вследствие возможного негативного воз-

действия озона на способность SP-A осуществлять свои иммуномодулирующие

функции в лёгких, а также снижение эффективности элиминирования патогенных

бактерий из лёгких на фоне чрезмерного воспаления с возможным повреждением

лёгочной ткани. Таким образом, в условиях окислительного стресса, эффектив-

ность работы механизмов иммунной защиты у представителей обоих полов при

пневмонии может быть значительно снижена, а описанные выше факторы могут

вносить вклад в неблагоприятные течение и исход пневмонии.

Гендерспецифические факторы, влияющие на уровень иммунной защи-

ты при пневмонии. На уровень иммунной защиты при пневмонии у представите-

лей разного пола могут влиять, в зависимости от наличия или отсутствия окисли-

тельного стресса, различные факторы (Рисунок 15).

В отсутствие окислительного стресса женский пол имеет преимущество

перед мужским, что может выражаться в виде более низкого уровня диссемина-

ции бактерий из лёгких в течение пневмонии, что, в свою очередь, может приво-

дить к менее выраженным экстрапульмонарным повреждениям у представителей

женского пола по сравнению с мужским. Таким образом, полученные результаты

могут объяснять преимущество женского пола по сравнению с мужским в уровне

иммунной защиты при пневмонии в отсутствии окислительного стресса.

В условиях окислительного стресса, мужской пол имеет преимущество пе-

ред женским. Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о

том, что сниженная эффективность фагоцитоза бактерий альвеолярными макро-

фагами, возможно, из-за более низкой функциональной активности SP-A в лёгких,

более выраженное воспаление в лёгких и более низкий уровень элиминирования

бактерий из лёгких, а также повышенный уровень кортизола в плазме крови могут

быть среди факторов, вносящих вклад в неблагоприятные течение и исход пнев-

монии у представителей женского пола по сравнению с мужским в условиях

окислительного стресса. Следовательно, в условиях окислительного стресса жен-

ский пол становится фактором, негативно влияющим на уровень иммунной защи-

ты при пневмонии.

41

Рисунок 15 – Гендерспецифические факторы, влияющие на уровень иммун-

ной защиты при пневмонии в отсутствие или при наличии окислительного стрес-

са, вызванного воздействием озона (модель).

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о

том, что общие и гендерспецифические факторы, влияющие на уровень иммунной

защиты при пневмонии, отличаются в зависимости от наличия или отсутствия

окислительного стресса, вызванного ингаляцией озона. Полученные результаты

позволяют предполагать, что в случае загрязнения атмосферного воздуха окси-

дантами, иммуномодулирующая активность белка SP-A поражается в различной

степени у разных пациентов в зависимости от геноспецифического состава SP-A

(содержания SP-A1 и SP-A2 и их соотношения). Поэтому, должно приниматься во

внимание влияние загрязнения атмосферного воздуха, в частности озоном, на им-

муномодулирующую активность белка SP-A, и на иммунный статус лёгких у че-

ловека, в целом.

ВЫВОДЫ

1. Белок SP-A2 человека стимулирует фагоцитоз бактерий альвеолярными

макрофагами in vitro в большей степени, чем SP-A1.

2. Аминокислотный остаток в позиции 85 в молекуле SP-A человека (ци-

стеин в SP-A1 или аргинин в SP-A2) отвечает за различие в функциональной ак-

42

тивности между SP-A1 и SP-A2. Замена данного аминокислотного остатка (на ар-

гинин в SP-A1 или на цистеин в SP-A2) приводит к реверсивному изменению со-

ответствующей геноспецифической профагоцитарной активности.

3. In vitro и in vivo окисление SP-A приводит к снижению способности

SP-A стимулировать фагоцитоз бактерий альвеолярными макрофагами. Стимули-

рующая активность SP-A человека снижается с повышением степени его окисле-

ния озоном in vitro. При этом под воздействием озона профагоцитарная актив-

ность SP-A2 снижается в большей степени, чем активность SP-A1.

4. Получены антитела, специфичные к аминокислотным последовательно-

стям SP-A1, которые могут быть использованы для определения относительного

содержания генных продуктов SP-A в лёгких человека.

5. Уровень иммунной защиты у SP-A (-/-) мышей при пневмонии снижен

по сравнению с мышами «дикого типа», а более высокий уровень окисления белка

SP-A у самок мышей «дикого типа» по сравнению с самцами коррелирует с уров-

нем их более высокой восприимчивости к пневмонии в условиях окислительного

стресса, вызванного воздействием озона.

6. Ингалирование озоном приводит к снижению иммунной защиты при

пневмонии у самок и самцов мышей в эксперименте. Факторами риска при пнев-

монии в условиях оксидантной нагрузки являются неэффективный фагоцитоз

бактерий альвеолярными макрофагами in vivo вследствие возможного снижения

иммуномодулирующей активности SP-A, и низкий уровень элиминирования бак-

терий из лёгких на фоне острого воспаления и обширной области поражения лёг-

ких.

7. Гендерспецифические факторы риска, влияющие на эффективность

иммунной защиты при пневмонии, проявляются в зависимости от наличия окис-

лительного воздействия озоном. Мужской пол является фактором риска в

условиях отсутствия окислительного стресса, тогда как в условиях наличия

окислительного стресса фактором риска становится женский пол.

8. За различный уровень иммунной защиты у самцов и самок мышей при

пневмонии в эксперименте в условиях ингалирования озоном отвечают половые

43

гормоны – дигидротестостерон и эстрадиол. Замена половых гормонов на

гормоны противоположного пола у гонадэктомированных лабораторных мышей в

эксперименте приводит к проявлению уровня восприимчивости к пневмонии,

характерной для противоположного пола.

9. Экспериментальная модель, основанная на полученных данных, описы-

вает общие и гендерспецифические факторы, влияющие на уровень иммунной

защиты при пневмонии в зависимости от наличия окислительного стресса.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

И ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Данные, полученные с использованием иммуномодулирующего белка SP-A,

позволяют предполагать, что пациенты, имеющие больше SP-A1 варианта, чем

SP-A2 в лёгких, будут нуждаться в более интенсивной терапии при пневмонии,

возможно, в том числе, путём введения экзогенного белка SP-A. Кроме того, по-

скольку различные факторы могут влиять на уровень иммунной защиты при

пневмонии у представителей разного пола в зависимости от присутствия оксидан-

тов в воздушной среде, необходимо проводить независимую оценку иммунологи-

ческих показателей у пациентов мужского и женского пола. При этом, в условиях

повышенного загрязнения воздушной среды оксидантами, пациенты женского

пола могут находиться в зоне риска из-за снижения уровня иммунной защиты, и,

поэтому, нуждаться в своевременном проведении профилактических мероприя-

тий и лечения, направленных на снижение тяжести заболевания.

Полученные на животных экспериментальные данные могут послужить

научной основой для проведения последующих клинических исследований у па-

циентов при пневмонии в условиях наличия оксидантов в воздушной среде.

44

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в рецензируемых научных журналах, рекомендо-

ванных ВАК:

1. Mikerov, A.N. SP-A1 and SP-A2 variants differentially enhance association

of Pseudomonas aeruginosa with rat alveolar macrophages / A.N. Mikerov, T.M. Um-

stead, W. Huang, W. Liu, D.S. Phelps, J. Floros // American Journal of Physiology -

Lung Cellular and Molecular Physiology. – 2005. – Vol. 288. - P. 150-158.

2. Tagaram, H.R. Characterization of a human surfactant protein A1 (SP-A1)

gene-specific antibody; SP-A1 content variation among individuals of varying age and

pulmonary health / H.R. Tagaram, G. Wang, T.M. Umstead, A.N. Mikerov, N.J.

Thomas, G.R. Graff, J.C. Hess, M.J. Thomassen, M.S. Kavuru, D.S. Phelps, J. Floros //

American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. - 2007. –

Vol. 292. - P. 1052-1063.

3. Wang, G. Effect of cysteine 85 on biochemical properties and biological func-

tion of human surfactant protein А variants / G. Wang, C. Myers, A. Mikerov, J. Floros

// Biochemistry. - 2007. - Vol. 46. - P. 8425-8435.

4. Mikerov, A.N. Surfactant protein A2 (SP-A2) variants expressed in CHO

cells stimulate phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa more than do SP-A1 variants /

A.N. Mikerov, G. Wang, T.M. Umstead, M. Zacharatos, N.J. Thomas, D.S. Phelps, J.

Floros // Infection and Immunity. - 2007. - Vol. 75. - P. 1403-1412.

5. Mikerov, A.N. Inhibition of hemagglutination activity of influenza A viruses

by SP-A1 and SP-A2 variants expressed in CHO cells / A.N. Mikerov, M. White, K.

Hartshorn, G. Wang, J. Floros // Medical Microbiology and Immunology. - 2008. - Vol.

197. - P. 9-12.

6. Mikerov, A.N. Impact of ozone exposure on the phagocytic activity of hu-

man surfactant protein A (SP-A) and SP-A variants / A.N. Mikerov, T.M. Umstead, X.

Gan, W. Huang, X. Guo, G. Wang, D.S. Phelps, J. Floros // American Journal of Physi-

ology - Lung Cellular and Molecular Physiology. - 2008. - Vol. 294. - P. 121-130.

7. Mikerov, A.N. Sex differences in the impact of ozone on survival and alveo-

lar macrophage function of mice after Klebsiella pneumoniae infection / A.N. Mikerov,

X. Gan, T.M. Umstead, L. Miller, V.M. Chinchilli, D.S. Phelps, J. Floros // Respiratory

Research. - 2008. - Vol. 9, № 24. - P. 1-9.

8. Mikerov, A.N. Ablation of SP-A has a negative impact on the susceptibility

of mice to Klebsiella pneumoniae infection after ozone exposure: sex differences / A.N.

Mikerov, R. Haque, X. Gan, X. Guo, D.S. Phelps, J. Floros // Respiratory Research. -

2008. - Vol. 9, № 77. – P. 1-17.

9. Floros, J. Genetic complexity of the human innate host defense molecules,

surfactant protein A1 (SP-A1) and SP-A2 - impact on function / J. Floros, G. Wang,

A.N. Mikerov // Critical reviews in eukaryotic gene expression. - 2009. - Vol. 19. - P.

125-137.

10. Ali, M. Differences in the BAL proteome after Klebsiella pneumoniae infec-

tion in wild type and SP-A -/- mice / M. Ali, T.M. Umstead, R. Haque, A.N. Mikerov,

W.M. Freedman, J. Floros // Proteome Science. - 2010. - Vol. 8, № 34. - P. 1-18.

45

11. Mikerov, A.N. Histopatologic evaluation of lung and extrapulmonary tissues

show sex differences in Klebsiella pneumoniae - infected mice under different exposure

conditions / A.N. Mikerov, T.K. Cooper, G. Wang, S. Hu, T.M. Umstead, D.S. Phelps,

J. Floros // International Journal of Physiology, Pathophisiology and Pharmacology. -

2011. – Vol. 3, № 3. – P. 176-190.

12. Durrani, F. Gonadal hormones and oxidative stress interaction differentially

affects survival of male and female mice after lung Klebsiella pneumoniae infection / F.

Durrani, D.S. Phelps, J. Weisz, P. Silveyra, S. Hu, A.N. Mikerov, J. Floros // Experi-

mental Lung Research. - 2012. - Vol. 38. - P. 165-172.

13. Mikerov, A.N. Impact of sex and ozone exposure on the course of pneumonia

in wild type and SP-A (-/-) mice / A.N. Mikerov, S. Hu, F. Durrani, X. Gan, G. Wang,

T.M. Umstead, D.S. Phelps, J. Floros // Microbial Pathogenesis. - 2012. - Vol. 52. - P.

239-249.

14. Микеров, А.Н. Роль сурфактантного белка А в иммунной защите лёгких

/ А.Н. Микеров // Фундаментальные исследования. - 2012. - №2. – С. 204-207.

15. Микеров, А.Н. Факторы, участвующие в модулировании механизмов

иммунной защиты легких при пневмонии / А.Н. Микеров // Проблемы особо

опасных инфекций. - 2012. - Вып. 111. – С. 81-83.

16. Mikerov, A.N. Effect of ozone exposure and infection on bronchoalveolar

lavage: Sex differences in response patterns / A.N. Mikerov, D.S. Phelps, X. Gan, T.M.

Umstead, R. Haque, G. Wang, J. Floros // Toxicology Letters. - 2014. - Vol. 230. - P.

333-344.

Тезисы и материалы докладов на научных конференциях:

17. Mikerov, A.N. Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa by SP-A genetic

variants / A.N. Mikerov, W.Huang, T.M.Umstead, G.Wang, D.Phelps J.Floros // The

99th American Thoracic Society International Conference, May 16-21, 2003, Seattle,

Washington, USA // Am. J. Respir. Crit. Care Med. – 2003. - Vol. 167. - P. A322.

18. Mikerov, A.N. Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa by human SP-A

variants exposed to ozone / A.N.Mikerov, W.Huang, T.M.Umstead, D.S.Phelps,

J.Floros // The Seventeenth Annual North American Cystic Fibrosis Conference, Octo-

ber 16-19, 2003, Anaheim, California, USA // Pediatric Pulmonology. - 2003. - Suppl.

25. - P. 279-280.

19. Mikerov, A.N. Human SP-A1 and SP-A2 allelic variants differ in their ability

to enhance phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa; effect of ozone-induced oxida-

tion / A.N. Mikerov, T.M.Umstead, W.Huang, G.Wang, W.Liu, D.S.Phelps, J.Floros //

FASEB summer research conferences «Lung surfactant: cellular and molecular biolo-

gy», July 24-29, 2004, Saxtons River, Vermont, USA. - M11. - P.19.

20. Mikerov, A.N. Human SP-A1 and SP-A2 allelic variants differ in their abil-

ity to enhance phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa; Effect of ozone-induced oxi-

dation / A.N. Mikerov, T.M. Umstead, W. Huang, G. Wang, W. Liu, D.S. Phelps,

J.Floros // Pediatric Research Day, Penn State Children’s Hospital, June 3, 2004, Her-

shey, Pennsylvania, USA.

46

21. Mikerov, A.N. SP-A2 stimulates phagosytosis of Pseudomonas aeruginosa

by human alveolar macrophages more effectively than SP-A1; impact of natural oxida-

tion of human SP-A on its activity / A.N.Mikerov, T.M.Umstead, W.Huang, G.Wang,

W.Liu, D.S.Phelps, J.Floros // The 100th American Thoracic Society International Con-

ference. Proceedings of the American Thoracic Society, May 20-25, 2005, San Diego,

California, USA.

22. Tagaram, H.R.S. Characterization of a human surfactant protein A (SP-A1) -

gene-specific antibody; SP-A1 protein variation among individuals as a function of age

and pulmonary healt / H.R.S.Tagaram, G.Wang, T.M.Umstead, A.N.Mikerov,

N.J.Thomas, G.R.Graff, J.C.Hess, T.M.Jane, K.S.Mani, D.S.Phelps, J.Floros // Pediatric

Research Day, Penn State Children’s Hospital, June 1, 2006, Hershey, Pennsylvania,

USA.

23. Mikerov, A.N. The effect of ozone treatment on mice survival after intratra-

cheal Klebsiella pneumoniae infection: gender differences / А.N. Mikerov, X. Gan,

T.M. Umstead, D.S. Phelps, J. Floros // Experimental Biology Meeting, April 28-May

2, 2007, Washington DC, USA // The FASEB Journal, Experimental Biology. - 2007. -

Part. 1, A9. – Abstr. 34.7.

24. Wang, G. Role of Cys85 of human SP-A variants on their biochemical prop-

erties and biological function / G. Wang, C. Myers, A. Mikerov, J. Floros // Experi-

mental Biology Meeting, April 28–May 2, 2007, Washington DC, USA // The FASEB

Journal, Experimental Biology. – 2007. - Part 1, A552. - Abstr. 607.17.

25. Mikerov, A.N. Sex Differences in the Impact of Ozone on Macrophage

Function of Wild Type and SP-A(-/-) Mice after Klebsiella pneumoniae Infection / A.N.

Mikerov, X. Guo, J. Floros // The American Society for Cell Biology 47th Annual

Meeting, December 1-5, 2007, Washington DC, USA. - P. 365. – Abstr. 1333.

26. Микеров, А.Н. Влияние озона на резистентность к пневмонии: половой

диморфизм на модели лабораторных мышей / А.Н. Микеров, Ю.Ю. Елисеев //

Материалы XIII Всероссийского конгресса «Экология и здоровье человека», 7-9

октября, 2008, Самара // Известия Самарского научного центра Российской ака-

демии наук. – 2008. - Т. 2. - С. 108-111.

27. Mikerov, A.N. Sex differences in the impact of ozone on survival and mac-

rophage function of wild type and SP-A (-/-) mice after Klebsiella pneumoniae infection

/ A.N.Mikerov, X.Gan, L.Miller, T.M.Umstead, X.Guo, V.Chinchilli, D.S.Phelps,

J.Floros // Pediatric Research Day, Penn State Children’s Hospital, April 15, 2008,

Hershey, Pennsylvania, USA.

28. Микеров, А.Н. Блокирование функции сурфактантного белка А в лёг-

ких приводит к снижению иммунорезистентности мышей к пневмонии после ин-

галяции озона: влияние половой принадлежности / А.Н. Микеров, Ю.Ю. Елисеев

// Материалы VII съезда аллергологов и иммунологов СНГ, 25-28 апреля, 2009,

Санкт-Петербург // Аллергология и иммунология. – 2009. - Т. 10, № 2. - С. 286.

29. Микеров, А.Н. Оценка иммуномодулирующей активности вариантов

сурфактантного белка А (SP-A) лёгких / А.Н. Микеров, Ю.Ю. Елисеев // Сборник

трудов X Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии,

47

иммунологии и иммунофармакологии», 20-23 мая, 2009, Казань // Российский ал-

лергологический журнал. – 2009. - Выпуск 1, № 3. - С. 251-252.

30. Phelps, D.S. Ablation of SP-A Has a Negative Impact on the Susceptibility

of Mice to Klebsiella pneumoniae Infection after Ozone Exposure: Sex Differences /

D.S. Phelps, A.N. Mikerov, R. Haque, X. Gan, X. Guo, J. Floros // American Thoracic

Society, May 15-20, 2009, San-Diego, California, USA. - P. А6268.

31. Wang, G. Alveolar Macrophages in Humanized Transgenic SP-A1 and SP-

A2 Mice Exhibit Differences in Their In Vivo Phagocytic Ability of K. pneumoniae:

Impact of Ozone / G. Wang, A.N. Mikerov, S. DiAngelo, S. Hu, M. Ali, J. Floros //

American Thoracic Society,

May 15-20, 2009, San-Diego, California, USA. - P.

A2577.

32. Микеров, А.Н Окислительная модификация сурфактантного белка А

лёгких окислителями воздуха приводит к снижению его профагоцитарной актив-

ности / А.Н. Микеров, Ю.Ю. Елисеев // Материалы Всероссийской научно-

практической конференции «Социальные проблемы медицины и экологии чело-

века», посвящённой 100-летию Саратовского государственного медицинского

университета. Издательство Саратовского медицинского университета, Саратов. -

2009. - С. 435-436.

33. Floros,

J. Sex differences in pulmonary clearance and dissemination of

Klebsiella pneumoniae and the effect of ozone exposure / J. Floros, A.N. Mikerov, T.K.

Cooper, G. Wang, S. Hu, F. Durrani, T.M. Umstead, D.S. Phelps // American Thoracic

Society, 2010, New Orleans, Louisiana, USA. - P. A6173.

34. Phelps, D.S. Differences in the BAL proteome after Klebsiella pneumoniae

infection in wild type and SP-A -/- mice / D.S. Phelps, M. Ali, A.N. Mikerov, W.M.

Freedman, R. Haque, J. Floros // American Thoracic Society, 2010, New Orleans, Loui-

siana, USA. - P. A2458. – Abstr. 815.

35. Mikerov, A.N. Effect Of Ozone Exposure And Klebsiella Pneumoniae Infec-

tion On Lung Host Responses In Male And Female Mice / A.N. Mikerov, T.M. Um-

stead, X. Gan, R. Haque, S. Hu, G. Wang, D.S. Phelps, J. Floros // American Thoracic

Society, May 13-18, 2011, Denver, Colorado, USA. - P. A1795.



Похожие работы:

«Белоусова Татьяна Игоревна Минеральная плотность костной ткани у лиц молодого возраста с пониженной массой тела и марфаноидной внешностью 14.01.04 – внутренние болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург – 2015 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования СанктПетербургский государственный педиатрический медицинский университет Министерства...»

«БЕРЕЗОВСКИЙ Дмитрий Павлович КОМПЛЕКСНАЯ СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ДИАГНОСТИКА И ЭКСПЕРТНАЯ ОЦЕНКА ТРОМБОТИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ (ЭКСПЕРТНО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.03.05 – Судебная медицина АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2015 член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Пиголкин Юрий Иванович доктор медицинских наук, профессор Кавалерский Геннадий Михайлович Мальцев Алексей...»

«АЛЕКСАНОВА ЕКАТЕРИНА МИЛЬТИАДОВНА РОЛЬ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ ДИСПЛАЗИИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ В ФОРМИРОВАНИИ ЭНДОМЕТРИОИДНЫХ КИСТ ЯИЧНИКОВ 14.01.01 – акушерство и гинекология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2015 доктор медицинских наук, профессор Геворкян Марианна Арамовна профессор кафедры акушерства и гинекологии №1 ГБОУ ВПО РостГМУ МЗ РФ доктор медицинских наук, профессор Дубровина Светлана Олеговна Ведущая...»





 
© 2015 www.z-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.